2. Direktmikroskopi, svamp (Blankophor- och Tuschfärgning)-svamp

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner

---

Direktmikroskopi, svamp

a. Blankophor/Calcofluor white färgning

Preparation: Biopserad hud, hår och nagelmaterial sönderdelas med skalpell så att små tunna vävnadsfragment kan placeras på ett objektglas. Vävnadspreparat får ligga 10 min eller över natten för bättre digerering. Ev. kan preparatet värmas försiktigt för att bättre lösa upp nagelmaterial. Likvor, urin och andra tunna kroppsvätskor centrifugeras vid 1500xg 10 min. En droppe av sedimentet får torka in på objektglas och 1 droppe Blankophorlösning med lut tillsätts. Täckglas läggs på. Kan läsas omedelbart.

• Blankophorlösning
  • Blankophor (B A Bayer)----- 20 mg
  • Aq. dest.----- 22,5 mL
  • 1 mol/L NaOH ----- 22,5 mL
  • Dimetylsulfoxid ----- 5 mL

Lösningen skyddas mot ljus och förvaras i rumstemperatur. Calcofluor white lösning finns kommersiellt tillgänglig från t.ex BD.

Blankophor och Calcofluor white har exitationsvåglängd 370-390 nm respektive 350 nm och emissionsvåglängd 435-470 nm respektive 440 nm.

Blankophor+NaOH och Calcofluor white betraktas som den känsligaste metoden men tillgång till fluorescensmikroskop behövs för att kunna se de fluorescerande svampstrukturerna. Observera att dessa preparat även kan betraktas i såväl ljusfält - faskontrast - som mörkfältsmikroskop. Strukturerna syns då på samma sätt som i ett KOH-preparat. KOH och NaOH används för att provmaterialet skall “lösas” upp medan ev. svamp förblir intakt.

Preparaten kan screenas i förstoring x100. Strukturerna studeras mer noga i x250 och ev. x400. Gäller (i princip) för allt provmaterial, alla svampar och färgningar.

Histopatologiska färgningar för svamp, Grocott och PAS, kan göras på vävnader. Gramfärgning rekommenderas för färgning av granulae vid mycetom. Studeras i x1000.

b. KOH-DMSO

Preparation: Materialet behandlas som i punkt a.

Reagens: 1) Sätt 40 mL DMSO till 60 mL Aq. dest. och blanda väl. 2) Väg upp 20 g KOH och lös i DMSO-vatten. 3) Förvara i lufttät flaska, t.ex. droppflaska.

Mikroskopi: Avläses i faskontrastmikroskop eller ljusmikroskop med x100-400. Artefakter i form av mosaikfenomen kan ses i hudprov.

c. Tusch

Denna färgning används endast för likvorprov för att diagnostisera kryptokockmeningit. Påvisning av kryptokockantigen med latexagglutination är avsevärt känsligare.

Preparation: Likvor centrifugeras 10 min vid 1500xg. En droppe sediment blandas med 1-2 1 µL-öglor tusch på ett objektglas.

Reagens: Finkornigt tusch, t.ex. Pelikan kan användas.

Mikroskopi: Ljusmikroskopi x250 eller x400 är lämplig. Typisk halo kan ses kring ev. knoppande jästceller = kryptokocker. OBS! Lyserade leukocyter kan förväxlas med kryptokocker!

d. Laktofenolbomullsblå eller metylenblåfärgning för M. furfur m.m.

Preparation: Då material inkommit på tejp på objektglas kan tejpen lyftas och tryckas mot agaryta, medan en droppe färglösning sätts på glaset och täckglas läggs på. Det går även att sätta tejpen mot en droppe färg på ett objektglas.

Reagens: 1 % metylenblålösning, alt. lactophenol cotton blue.

Mikroskopi: Preparatet undersöks först med 10x objektiv och detaljgranskas sedan med 40x objektiv. Vid pityriasis versicolor ses Malassezia som blastokonidier i hopar (klasar) och korta, rätt tjocka hyfer.

e. För övriga färgningar, som Grocott silver, PAS etc

Hänvisas till klinisk patologi