Bilaga 1: Substratrecept- Hud, mjukdelar, skelett och inre organ

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Bakteriologisk diagnostik av infektioner i hud, mjukdelar, skelett och inre organ


Substratrecept

Urvalet av referenssubstrat i denna gula bok har följt principen att finna medier som effektivast möjligt understödjer vÀxt av beskrivna mikroorganismer. Alla laboratorier mÄste inte nödvÀndigtvis anvÀnda just dessa substrat, Àven om det genom inventerande EQUAS-utskick kan konstateras att sÄ sker i mÄnga fall. De enskilda laboratoriernas substratval följer traditioner baserade pÄ lokala erfarenheter, kunskaper och uppfattningar. Tanken Àr att referenssubstraten dÀrvid skall utgöra valideringsgrund vid det lokala substratvalet. Ett problem vid sÄdana valsituationer Àr att olika fabrikat av ett substrat med synbarligen samma recept (eller olika recept för den delen) kan ha olika egenskaper och fungera mer eller mindre vÀl. Betydande batchvariationer förekommer ocksÄ. Det Àr alltsÄ lÀmpligt att t ex. inför en upphandling jÀmföra angivet referenssubstrat mot en uppsÀttning av alternativa substrat dÀr det förra inte nödvÀndigtvis Àr det som visar sig ha de bÀsta egenskaperna.

För referenssubstraten anges firmanamn och katalognummer för spÄrbarhet till typrecept.

NÀringsberikade fasta substrat för isolering av aeroba och fakultativt anaeroba bakterier (blodagar, hematinagar och CLED-agar)

Till blod- och hematinagar anvÀnds specialkomponerade blodagarbaser som finns kommersiellt tillgÀngliga. I dessa ingÄr ofta skonsamt enzymdigererat kasein som tillhandahÄller peptider och aminosyror med lÄgt kolhydratinnehÄll och bibehÄllen hög halt av tryptofan. Det senare möjliggör test av indolreaktion. Extrakt av köttprotein ger ytterligare aminosyror, vitaminer, spÄrelement etc. Dessa komponenter Àr definierade i US Pharmacopeia. Tillsatt autolysat av bakjÀst bidrar till snabb tillvÀxt och ger substraten goda differentierande egenskaper. MajsstÀrkelse absorberar toxiska metaboliter inklusive fria fettsyror vilket bidrar till sÀker tillvÀxt. Ett generellt problem med blodagarbaser Àr det relativt höga innehÄllet av reducerande kolhydrater vilket negativt pÄverkar den hemolytiska kapaciteten hos betastreptokocker. Columbia blodagarbas enligt Ellner et al (1966) Àr speciellt komponerad för snabb tillvÀxt och differentiering och relationen mellan ingÄende peptoner har avvÀgts sÄ att streptokockernas förmÄga att producera betahemolysin optimerats. Columbia blodagarbas Àr dÀrför lÀmplig som referensbas för blodagar.

Columbiablodagarbas och Blodagarbas II kan anvÀndas som bas för hematinagar (chokladiserad blodagar) avsedd att understödja vÀxt ocksÄ av Haemophilus- och Neisseria-arter. Emellertid utgör traditionellt Carpenter och Johnstons gc-agarbas grundmedium i hematinagar. Denna bas skiljer sig frÄn andra blodagarbaser genom nÄgot mindre agarmÀngd och fosfatbuffring. I kombination med hemoglobin och andra tillvÀxtfaktorer erhÄlls ett mycket nÀringsrikt medium som innehÄller bland annat bundet oxiderat hem (hematin, X-faktor) och NAD (V-faktor). Hematinplattor med Gc-agarbas utgör dÀrmed referenssubstrat, vilka ocksÄ, till skillnad frÄn andra hematinagartyper kan anvÀndas för resistensbestÀmning av gonokocker.


1. Blodagar

Indikation: Substrat anrikat med hÀstblod för isolering av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer samt olika gramnegativa stavar, Neisseria (ej gonokocker), stafylokocker, pneumokocker och streptokocker frÄn kliniska prov.

Princip: Columbia blodagarbas Ă€r ett vĂ€lkomponerat grundmedium med bland annat kaseinhydrolysat och köttextrakt som kvĂ€ve- och kolhydratkĂ€llor avsett att anvĂ€ndas anrikat med 5-10 % valfritt blod. Vanligen anvĂ€nds 5 % defibrinerat hĂ€stblod vilket ger distinkt betahemolys med olika streptokocker, vissa stammar av enterokocker och Listeria. Defibrinerat hĂ€stblod har ringa tendens att chelera metalljoner och ger ofta frodigare kolonier Ă€n om citratblod anvĂ€nds. MĂ„nga fabrikat av Columbia blodagarbas Ă€r inte avpassade för citratblod vilket ocksĂ„ gĂ€ller referenssubstratet. Betahemolys orsakas av hemolys av de röda blodkropparna medan alfahemolys orsakas av att hemoglobinet i helt eller delvis intakta röda blodkroppar reduceras till methemoglobin. För blodagar avsedd för pĂ„visande av betastreptokocker i svalgodlingar brukar istĂ€llet 5-10 % fĂ„rblod rekommenderas, eftersom exempelvis enterokocker ofta inte ger betahemolys pĂ„ sĂ„dant blod. FĂ„rblod tenderar ocksĂ„ att undertrycka normalflora, sĂ€rskilt Haemophilus, mer Ă€n hĂ€stblod. FĂ„rblodplattor kan gjutas dubbelskiktade för att underlĂ€tta avlĂ€sningen.

VĂ€xtkarakteristika: (se tabell 14).

PÄ hÀstblodagar vÀxer de flesta bakteriearter ut inom ett dygn. Kolonistorlek och utseende varierar kraftigt mellan olika arter trots att mediet inte i klassisk bemÀrkelse Àr differentierande. Flera bakteriearter uppvisar alfa- eller betahemolys, den senare med större sÀkerhet om plattorna inkuberas anaerobt. Ett flertal bakterietyper vÀxer svagt eller inte alls pÄ hÀstblodagar. Dit hör bland andra Haemophilus influenzae, Legionella och gonokocker.


  • Recept: (Columbia blodagarbas, Acumedia no 7125)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pankreasdigererat kasein---- 5,0
    • Köttextrakt---- 8,0
    • JĂ€stanrikad pepton--- 10,0
    • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
    • NaCl---- 5,0
    • Agar---- 14,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C


Bered 5 % blodagar genom tillsats av sterilt, defibrinerat hĂ€stblod (alternativt fĂ„rblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.

2. Hematinagar (Chokladiserad blodagar)

Indikation: NÀringsberikat medium för isolering av gonokocker, meningokocker och Haemophilus influenzae frÄn kliniska prov. ResistensbestÀmning av gonokocker.

Princip: Gc-agarbasbaserat medium som nÀringsberikas antingen med hemoglobin (torkat nötblod) och Isovitalex eller med hemolyserat hÀstblod och hÀstserum. Gc-agarbas utnyttjar som mÄnga andra blodagarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt som kvÀve- och kolhydratkÀlla. Reducerad agarmÀngd och fosfatbuffring bidrar till bÀttre och snabbare vÀxt av framförallt gonokocker. Hemoglobin och Isovitalex (liksom lyserat hÀstblod och serum) tillför mediet bland annat X-faktor och V-faktor, en förutsÀttning för vÀxt av H. influenzae, men bidrar ocksÄ till god vÀxt av Neisseria-arter. Hematinagar anvÀnds ocksÄ med tillsats av selekterande antibiotika (Modifierad Thayer-Martin-agar, VCNT-supplement) för isolering av gonokocker frÄn kliniska prov. PÄ grund av sitt innehÄll av cystein stödjer substratet ocksÄ vÀxt av Francisella tularensis. Hematinagar och modifierad Thayer-Martin-agar kan dÀrvid anvÀndas som alternativ till referenssubstratet Tularemiagar.

VĂ€xtkarakteristika: (se tabell 14).

Meningokocker, gonokocker och Haemophilus vĂ€xer inom ett dygn med ”feta” blanka grĂ„a kolonier, 0,5-2 mm. PĂ„ hematinagar vĂ€xer ocksĂ„ inom ett dygn (ofta med kraftigare vĂ€xt efter tvĂ„ dygn) pneumokocker och streptokocker med tydlig alfahemolys (gĂ€ller inte t.ex. GBS), stafylokocker (vita eller gulgrĂ„a kolonier), Listeria (stora matta platta kolonier) och ett flertal arter av gramnegativa stavar (stora ofta ”rĂ„a” kolonier). Candida albicans vĂ€xer inom ett till tvĂ„ dygn med karakteristiskt ”stjĂ€rn-” formade vita, matta kolonier.


  • Recept: (Gc-agarbas, Acumedia no 7104)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pankreasdigererat kasein---- 7,5
    • Köttextrakt---- 7,5
    • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
    • Di-kaliumfosfat---- 4,0
    • Mono-kaliumfosfat---- 1,0
    • NaCl---- 5,0
    • Agar---- 10,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C


Tillred hematinagar genom tillsats av hemoglobinpulver 10 g och IsoVitaleX 10,0 mL enligt tillverkarens anvisningar.


  • Recept: IsoVitaleX (BBL, no 11876)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Vitamin B12---- 0,1
    • L-glutamin---- 10,0
    • Adenin---- 1,0
    • Guanin HCl---- 0,03
    • p-Aminobensoesyra---- 0,013
    • Nikotinamid-adenin-dinukleotid---- 0,25
    • Tiamin pyrofosfat---- 0,1
    • JĂ€rnnitrat---- 0,02
    • Tiamin HCl---- 0,003
    • L-cystein HCl---- 25,9
    • L-cystin----- 1,1
    • D-Glukos---- 100,0

3. Andra beredningsformer av blod- och hematinagar

OvanstÄende agarmedier utgör referenssubstrat. Dock kan andra beredningsformer förekomma pÄ de enskilda laboratorierna. Det Àr dÀrvid viktigt att validera dessa substrat mot referenssubstraten.

Blodagar:

Moderna kommersiella blodagarbaser har ofta goda egenskaper och Àr relativt likvÀrdiga. Alternativ till Columbia agarbas Àr Blodagarbas II. Det skall observeras att sÀrskilt betahemolys kan pÄverkas beroende pÄ vilken bas som vÀljs. Med Blodagarbas II erhÄlls utmÀrkt vÀxt, men betahemolys kan bli odistinkt, dubbel, sÀrskilt med fÄrblod.


  • Recept: (Blodagarbas II, OX0ID, CM 271)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Proteos pepton---- 15,0
    • Digererad lever---- 2,5
    • JĂ€stextrakt---- 5,0
    • NaCl---- 5,0
    • Agar---- 12,0

pH 7,4 ± 0,2 vid 25 °C


Preparera 5 % blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hĂ€stblod (alternativt fĂ„rblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.


Hematinagar:

SÄdan agar kan tillverkas med vilken blodagarbas som helst. Det skall observeras att endast hematinagar baserad pÄ gc-agarbas lÀmpar sig för resistensbestÀmning av gonokocker.

  • Recept: Hematinagar (alternativ för isolering av H. influenzae och Neisseriae)
    • Columbia blodagarbas med tillsats av:
    • HĂ€stblod i lösning---- 8,5 %
    • Normalserum frĂ„n hĂ€st 5-10 %

Tillverkas med chokladisering av blodet.

4. CLED-agar

CLED-agar, blandflora dominerad av E. coli som framtrÀder gulfÀrgade. Foto: Camilla Svensson

Indikation: Referenssubstrat för (i första hand) isolering av urinvÀgspatogener frÄn urinprov, och Enterobacteriaceae vid allmÀn odling.

Princip: CLED Àr en förkortning av Cystein-Lactose-Electrolyt-Deficient utvecklat av Sandys och Mackey. Substratet Àr ickeinhibitoriskt men inte lika nÀringsrikt som blodagar. InnehÄller sÄvÀl kaseinhydrolysat som köttextrakt och understödjer dÀrmed vÀxt av ett stort antal kliniskt relevanta bakterietyper. Karakteristiskt för detta substrat Àr avsaknaden av elektrolyter, vilket hindrar svÀrmning i första hand av Proteus. Mindre selektivt men för övrigt funktionellt nÀra saltfri McConkey-agar. Laktospositiva bakterier blir gula medan laktosnegtativa behÄller mediets blÄa grundfÀrg. Kontaminanter frÄn urogenital flora (laktobaciller, mikrokocker och difteroider) vÀxer ofta ut som mikrokolonier pÄ plattan, vilket indikerar förorening.

VÀxtkarakteristika: (se tabell 14). E. coli och andra gramnegativa bakterier vÀxer inom ett dygn med relativt stora (diameter >2mm), opaka, blanka, slÀta kolonier. Laktospositiva bakterier blir gulfÀrgade, ofta med gult fÀrgomslag i substratet. Grampositiva bakterier som stafylokocker och enterokocker vÀxer med mindre, ofta gula kolonier (diameter 1-2mm). Growth index för de flesta bakterietyper nÀra de för blodagar.


  • Recept: CLED-agar (enligt Mackey och Sandys, OXOID CM301)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pepton---- 4,0
    • ”Lab-Lemco” pulver---- 3,0
    • Trypton---- 4,0
    • Laktos---- 10,0
    • L-cystein---- 0,128
    • BromtymolblĂ„tt---- 0,02
    • Agar---- 15,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C

Generella och selektiva nÀringsberikade fasta substrat för isolering av anaeroba bakterier frÄn kliniska prov

De flesta typer av kliniskt relevanta anaeroba bakterier vĂ€xer bra pĂ„ substrat baserade pĂ„ blodagarbaser (exempel Ă€r Blodagarbas II, Columbiaagar, Brain-heart-infusion-agar, Schaedleragar, Tryptic soy agar, Brucellaagar etc.) om dessa anrikats med 5-10 % hĂ€st- eller fĂ„rblod, hemin och menadion (vitamin K). Tillsats av cystein bidrar till att sĂ€nka redoxpotentialen. Eftersom sĂ„dan blodagar ocksĂ„ understödjer vĂ€xt av ett flertal fakultativt anaeroba bakteriearter kan smĂ„ mĂ€ngder anaeroba bakterier förbises. Det Ă€r dĂ€rför ofta lĂ€mpligt att genom antibiotikatillsats eller, genom applikation av t. ex. metronidazol – och gentamicinlappar i primĂ€rstryket göra mediet selektivt för anaeroba bakterier. Alla dessa substratberedningar har relativt hög kolhydrathalt, varför betahemolys kan bli grönaktig. Brucellaagar Ă€r sĂ€rskilt lĂ€mpad för isolering av gramnegativa stavar.

Tillredningen av dessa berikade blodagartyper Àr relativt komplicerad vilket kan medföra variationer i den fortlöpande tillverkningen. Fastidious anaerobe agar (FAA, LabM) har valts som referenssubstrat eftersom grundberedningen innehÄller alla de tillvÀxtbefrÀmjande komponenter som beskrivs ovan. FAA har i kliniska utvÀrderingar visat sig likvÀrdig eller bÀttre Àn Columbia-agarbaserad blodagar eller brain-heart-infusionagar.


5. Anaerob blodagar (FAA)

Indikation: Substrat avsett för primÀr isolering av flera typer av kliniskt relevanta anaeroba bakterier frÄn kliniska prov.

Princip: Fastidious anaerobe agar (FAA) Ă€r en i grunden vĂ€l balanserad blodagarbas med speciell peptonmix som kvĂ€ve- och frĂ€msta kolhydratkĂ€lla. Mediet innehĂ„ller stĂ€rkelse och bikarbonat vilka bĂ„da neutraliserar toxiska metaboliter. FAA innehĂ„ller ocksĂ„ hemin och vitamin K, vilka utgör tillvĂ€xtfaktorer för ett flertal arter av anaeroba bakterier. Cystein sĂ€nker redoxpotentialen och pyruvat bidrar till neutralisering av vĂ€teperoxid. Substratet förstĂ€rks med 5 % hĂ€stblod, vilket förutom att bidra med ytterligare tillvĂ€xtfaktorer ocksĂ„ möjliggör bedömning av hemolys.

VĂ€xtkarakteristika: se tabell 14.


  • Recept: Fastidious anaerobe agar (FAA, LABM Lab 90)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Peptonmix---- 23,0
    • NaCl---- 5,0
    • StĂ€rkelse---- 1,0
    • Agar no 2---- 12,0
    • Na-bikarbonat---- 0,4
    • Glukos---- 1,0
    • Na-pyruvat---- 1,0
    • Cystein HCl monohydrat---- 0,5
    • Hemin---- 0,01
    • Vitamin K---- 0,001
    • L-arginin---- 1,0
    • Pyrofosfat---- 0,25
    • Na-succinat---- 0,5

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C


Kontrollstammar: se tabell 14.

Tillred 5 % anaerob blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hĂ€stblod enligt tillverkarens anvisningar.


Vid utvidgad anaerob diagnostik Ă€r bruk av selektiv anaerob blodagar, referensmetod. FAA och andra medier kan göras selektiva för anaeroba bakterier genom antibiotikatillsats. Traditionellt anvĂ€nds ofta sĂ„ kallad kanamycin (75 – 100 mg/L) –vankomycin (7,5 mg/L) –agar (referenssubstrat). Denna Ă€r selektiv för Bacteroides fragilis-gruppen och ocksĂ„ lĂ€mpad för isolering av pigmenterade Prevotella species. Det skall dock observeras att flera Bacteroides-arter, Wolinella, fusobakterier, Bilophila och Porphyromonas liksom grampositiva anaerober ej vĂ€xer pĂ„ detta selektiva substrat. FAA med tillsats av neomycin, 100 mg/L (referenssubstrat) Ă€r sĂ€rskilt lĂ€mpad för isolering av klostridier. Den inhiberar Enterobacteriaceae, men ocksĂ„ vissa gramnegativa anaerober.

6. Andra beredningsformer av anaerob blodagar

OvanstĂ„ende anaerob FAA-blodagar utgör referenssubstrat. Andra beredningsformer kan förekomma. Vid lot-inköp Ă€r det viktigt att validera alternativen mot referenssubstratet. Vanligt alternativ till FFA-agarbas Ă€r nĂ€ringsberikad Brucella-agar med 5-10 % hĂ€stblod.


  • Recept: (Brucellaagar, Acumedia no 7120)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Digererat kasein---- 10,0
    • Pepsindigererad djurvĂ€vnad---- 10,0
    • JĂ€stextrakt---- 2,0
    • NaCl---- 5,0
    • Glukos---- 1,0
    • Na-bisulfit---- 0,1
    • Agar---- 15,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C


Bered anaerob blodagar genom tillsats av cysteinhydroklorid 0,5 g/L, hemin 5 mg/L och vitamin K 1 mg/L vid max 50 °C. Samtidigt tillsĂ€tts defibrinerat hĂ€stblod till 5 % i anaerob blodagar. Beredningen av selektiv agar som ovan för FAA.

Flytande substrat för anrikning av aeroba och anaeroba bakterier

Dessa substrat Ă€r avsedda för mikrobiell anrikning av kliniska prov som innehĂ„ller fĂ„ eller enstaka bakterier. Beredningarna Ă€r komponerade för att anrika flera olika typer av aeroba och anaeroba bakterier. ”Aeroba” buljonger kan ha kasein- och sojabönshydrolysat (Tryptic soy broth, TSB-buljong) som kvĂ€ve- och kolhydratkĂ€lla. Alternativ Ă€r buljong baserad pĂ„ pepton frĂ„n köttextrakt (Nutrient broth nr2) eller infusion frĂ„n hjĂ€rna och hjĂ€rta (brain-heart-infusion, BHI- buljong). Buljongerna understödjer vĂ€xt av de flesta aerobt vĂ€xande organismer utom Haemophilus och Neisseriae. NĂ€ringsberikning Ă€r dĂ€rför nödvĂ€ndig nĂ€r dessa bakterier misstĂ€nks och anrikning önskas (ej referensmetodik). TSB berikad med Fildes supplement och inaktiverat hĂ€stserum rekommenderas (ej referenssubstrat). Fildes supplement utgörs av pepsindigererat, syra- och alkalibehandlat defibrinerat hĂ€st- eller fĂ„rblod, och innehĂ„ller ett flertal olika tillvĂ€xtfaktorer inklusive fritt hemin (X-faktor) och koenzym (V-faktor) för vĂ€xt av Haemophilus och meningo- och gonokocker. Fritt hemin Ă€r toxiskt för streptokocker inklusive pneumokocker. Denna effekt neutraliseras genom tillsats av 5-10 % inaktiverat hĂ€stserum, motsvarande mĂ€ngd albumin eller aktivt kol.

Det finns ett antal bra ”anaeroba” buljonger vilka dock inte Ă€r lĂ€mpade för anrikning av gonokocker och meningokocker (se ovan). Ett traditionellt basmedium som ofta rekommenderas Ă€r cooked meat medium (CM-buljong). Detta Ă€r sĂ€rskilt effektivt för lĂ„ngtidsförvaring av anaeroba bakterier. TyvĂ€rr Ă€r CM-buljongen Ă€ven i kommersiella beredningar nĂ„got komplicerad att bereda vilket kan leda till variationer i den fortlöpande tillverkningen. VĂ€xtsĂ€tt av olika bakterietyper framtrĂ€der heller inte tydligt med denna buljong. Andra medier Ă€r Schaedler-buljong, nĂ€ringsberikad BHI och olika typer av tioglykollatbuljonger dĂ€r fastidious anaerobe broth (FAB, LabM) Ă€r i klass med CM-buljong och utgör referenssubstrat för anrikning av kliniska prov. Valet av denna buljong baseras bland annat pĂ„ förmĂ„gan att anrika Ă€ven anaeroba bakterier i aerob miljö och ett tydligt typrecept. FAB har i sin grundberedning tillsatser av L-cystein, Na-tioglykollat och en liten mĂ€ngd agar som bidrar till att hĂ„lla buljongen tillrĂ€ckligt anaerob Ă€ven i aerob miljö.


7. Anaerob anrikningsbuljong (FAB)

Indikation: För anrikning av ett stort antal kliniskt relevanta aeroba och anaeroba bakterier frÄn kliniska prover och eventuellt transport av kliniska prover.

Princip: FAB Àr ett mycket nÀringsrikt substrat baserat pÄ speciell peptonmixtur som kvÀve- och kolhydratkÀlla och med jÀstextrakt som nÀringstillskott. L-cystein och Na-tioglykollat bidrar till att reducera buljongen. SmÄ mÀngder agar bidrar till att bibehÄlla anaerobios (redox-indikator resazurin, rosa fÀrgomslag i översta buljongskiktet indikerar aerob miljö dÀr men för övrigt anaerob miljö i röret). Till skillnad frÄn andra tioglykollatbuljonger och CM-buljong Àr hemin och menadion tillsatta redan till grundberedningen. Trots goda egenskaper uppvisar FAB liksom övriga anaeroba buljongtyper ofta svag vÀxt av fusobakterier och anaeroba grampositiva kocker, vilka kan krÀva tre till sju dygns inkubationstid.

För optimal anaerobios rekommenderas i viss litteratur inkubering i anaerob miljö, men de flesta kliniskt relevanta anaeroba bakterier vÀxer utmÀrkt Àven vid aerob inkubering. DÀrvid vÀxer obligat anaeroba bakterier i rörets nedre del. Obligat aeroba bakterier vÀxer bara i ytskiktet medan fakultativt anaeroba och aerotoleranta anaerober vÀxer i hela buljongen.

Enterobacteriacae tenderar att svÀrma diffust i mediet medan de flesta andra bakterietyper vÀxer utefter inokulationssticket eller intill provmaterialet. Neisseriae liksom vissa streptokockisolat vÀxer dÄligt eller inte alls.

VĂ€xtkarakteristika: Se bilaga 2 och tabell 14.


  • Recept: Tioglykollatbuljong-FAB (LabM, LAB 71 )
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Peptonmixtur---- 5,0
    • JĂ€stextrakt---- 10,0
    • NaCl---- 2,5
    • L-cystein---- 0,5
    • Na-tioglykollat---- 0,5
    • Agar no 1---- 0,75
    • Resazurin---- 0,001
    • Na-bikarbonat---- 0,4
    • Hemin---- 0,005
    • Vitamin K---- 0,0005

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

8. Alternativ aerob anrikningsbuljong (TSB)

Indikation: För anrikning av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba bakteriearter (utom Haemophilus, meningo- och gonokocker) frÄn kliniska prov (ej referensmetod).

Princip: I sin grundberedning Ă€r TSB ett mycket nĂ€ringsrikt medium som Ă€r lĂ€mpat för anriking av en mĂ„ngfald olika bakterietyper i smĂ„ mĂ€ngder (i synnerhet streptokocker). Tillsats av Fildes supplement ger mediet tillgĂ„ng till extra tillvĂ€xtfaktorer, inkluderande hemin (X-faktor) och koenzym (V-faktor). DĂ€rmed kan ocksĂ„ smĂ„ mĂ€ngder av Haemophilus och meningo- och gonokocker anrikas inför sekundĂ€r utodling. Samtidig tillsats av inaktiverat 5-10 % hĂ€stserum Ă€r dĂ€rvid nödvĂ€ndig för att bibehĂ„lla buljongens generella egenskaper. Dessa tillsatser höjer dock priset avsevĂ€rt (ca 10-falt), varför anrikad buljong bara rekommenderas för situationer dĂ€r sĂ„dana bakterier speciellt misstĂ€nks. Fildes supplement kan ersĂ€ttas av 0,1-1 % Isovitalex och hemoglobin (innehĂ„ller bundet, dĂ€rmed atoxiskt hematin) varvid serumtillsats ej Ă€r nödvĂ€ndig.


  • Recept: (Tryptic soy broth, TSB, Acumedia no 7164)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pankreasdigererat kasein---- 17,0
    • Papaindigererat sojabönsmjöl---- 3,0
    • NaCl---- 5,0
    • Di-Kaliumfosfat---- 2,5
    • Glukos---- 2,5

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C


Vid beredning av nĂ€ringsberikad TSB (”Fildes buljong”) tillsĂ€tts Fildes peptic digest of blood (Oxoid, SR46) 25-50 mL till 1000 mL TSB. Detta gör buljongen svagt ”rökfĂ€rgad” men fortfarande genomskinlig. Buljongen balanseras genom tillsats av inaktiverat hĂ€stserum 50-100 mL till 1000 mL TSB. Alternativt tillsĂ€tts 0,1-1,0 % Isovitalex (BBL) och 0,1-1,0 % bovint hemoglobinpulver (OXOID, L53).

Kontrollstammar: se tabell 14.

Övriga substrat

9. Fenolmannitagar (FM-agar)

Indikation: För isolering av stafylokocker frÄn kliniska prov och preliminÀr identifiering av S. aureus (ej referensmetod i denna bok).

Princip: FM-agar (utan antibiotika) Ă€r modifierad efter G H Chapmans ursprungliga rekommendationer av agarmedium med hög salthalt för selektiv isolering av stafylokocker med differentiering av S. aureus genom dessas förmĂ„ga att jĂ€sa mannit. Observera att Ă€ven vissa stammar av koagulasnegativa stafylokocker kan jĂ€sa mannit. Selektivitet för stafylokocker uppnĂ„s genom hög koncentration av NaCl (7,5 %), en nivĂ„ som utesluter vĂ€xt av praktiskt taget alla övriga humanpatogena bakterier med undantag för Vibrio. GrundfĂ€rg ljust röd pĂ„ grund av nĂ€rvaro av indikatorn fenolrött. Vid jĂ€sning av mannit gulfĂ€rgas kolonier och mediet runt dessa. PĂ„visande av gelatinhydrolys (Stone-reaktion pĂ„ gelatinhaltigt medium) hos S. aureus krĂ€ver media med lĂ€gre salthalt (5,5 % NaCl, Chapman-Stone-medium).

VÀxtkarakteristika: S. aureus vÀxer inom 24 tim med matta, slÀta gulvita kolonier ca 1 mm i diameter med gulfÀrgad zon i mediet runt kolonierna. Vissa stammar av koagulasnegativa stafylokocker kan ha samma vÀxtsÀtt, men ofta Àr dessas kolonier vita. Föga vÀxt av andra bakterietyper.


  • Recept: Fenolmannitagar (Mannitol-Salt Agar, OXOID CM85)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • ”Lab-Lemco” pulver---- 1,0
    • Pepton---- 10,0
    • Mannit---- 10,0
    • NaCl---- 75,0
    • Fenolrött---- 0,025
    • Agar---- 15,0

pH 7,5 ± 0,2 vid 25 °C

10. Selektiv fenolmannitagar (MS-agar)

Indikation: Selektiv isolering av meticillinresistenta stafylokocker i kliniska prov.

Princip: Detta medium (MSA) skiljer sig frĂ„n FM-agar genom lĂ€gre salthalt (3 %) för optimal sensitivitet avseende meticillinresistenta S. aureus. Selektivitet för stafylokocker bibehĂ„lls genom tillsats av litiumklorid som hĂ€mmar gramnegativa bakterier. Selektivitet för meticillinresistenta stafylokocker uppnĂ„s genom tillsats av t.ex. oxacillin 1 mg/L.


  • Recept: Selektiv fenolmannitagar (Mast Diagnostic DM 160)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • NaCl---- 30,0
    • Mannit---- 10,0
    • Pepton---- 8,0
    • JĂ€stextrakt---- 2,0
    • Laktalbumin---- 3,0
    • Litiumklorid---- 7,0
    • Glycin---- 1,0
    • Na-pyruvat---- 3,0
    • Fenolrött---- 0,025
    • Agar---- 12,0

pH 7,4 ± 0,2 vid 25 °C


Selektiv fenolmannitagar bereds genom tillsats av t.ex. oxacillin (LabKemi, TAB/OX-0,1) 0,1 mg tabletter till 100 ml medium. Se för övriga aktuella rekomendationer RAFs hemsida [1]

11. Selektiv anrikningsbuljong för betahemolyserande streptokocker (hĂ€r anvĂ€nd som ”GBS-buljong”)

Indikation: För anrikning av GBS i pinnprov frÄn vagina och andra lokaler samt frÄn odlingar pÄ nyfödda.

Princip: Todd-Hewitt-buljong (THB) formulerades ursprungligen för produktion av hemolysiner frÄn streptokocker. Buljongen fungerar ocksÄ utmÀrkt för anrikning av streptokocker och enterokocker och för odling inför serologisk gruppering. Detta nÀringsrika medium baserat pÄ infusion av kött Àr speciellt buffrat för att bibehÄlla ett neutralt pH trots mikrobiell vÀxt.

THB liksom vissa fasta substrat som Columbia blodagar och Islam-agar kan göras selektiv för betahemolyserande streptokocker genom tillsats av antibiotika. Vanligen tillsÀtts dÀrvid gentamicin och nalidixinsyra (referensbuljongen). Vissa mÄlbakterier inhiberas dock av denna kombination varför andra selektiva antibiotikakombinationer prövats. Kolistin och nalidixinsyra (LIM-buljong) rekommenderas dÀrvid av CDC, men kombinationen Kolistin+oxolinsyra kan med fördel anvÀndas eftersom denna effektivt inhiberar Àven stafylokocker. För att optimera GBS-buljongen anger vi hÀr reducerad mÀngd gentamicin 2 mg/L (istÀllet för 8 mg/L) och nalidixin 15 mg/L.


  • Recept: Todd-Hewitt-buljong (OXOID, CM 189)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Infusion av kött---- 10,0
    • Trypton---- 20,0
    • Glukos---- 2,0
    • NaCl---- 2,0
    • Di-Na-fosfat---- 0,4
    • Na-karbonat---- 2,0

pH 7,8 ± 0,2 vid 25 °C


THB-buljongen tillreds enligt tillverkarens anvisningar. GBS-buljong bereds genom tillsats av gentamicin 2 mg/L och nalixinsyra 15 mg/L. Alternativt ersĂ€tts gentamicin med Kolistinsulfat 10-13 mg/L. Nalidixin kan ersĂ€ttas med oxolinsyra 5 mg/L. Eventuellt kan 5 % fĂ„rblod tillsĂ€ttas för att ytterligare berika buljongen.

Kontrollstam : GBS CCUG 4208, se ocksĂ„ tabell 14.

12. Selektiv anrikningsbuljong för vankomycinresistenta enterokocker (VRE) med vanA-gen

Den beredning som ofta anvĂ€nts Ă€r identisk med den selektiva Todd-Hewitt buljong som beskrivs ovan som ”GBS”-buljong med anvĂ€ndande av gentamicin (2 mg/L) och nalidixinsyra (15 mg/L). Selektivitet för VRE uppnĂ„s genom tillsats av vankomycin 32 mg/L. Observera att vankomycintillsatsen senare Ă€r Ă€ndrad till 4 mg/L (2012) sĂ„ att buljongen Ă€ven ska kunna selektera/anrika VRE med vanB-gen. Detta rekommenderas vid screening för VRE, se aktuell referensmetodik Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik


Kontrollstammar: E. faecalis ATCC 29212 (vanko-S) och E. faecium CCUG 36804 (vanko-R, van A-typ). Se ocksÄ tabell 14 och bilaga 2.

13. Transportsubstrat för bakteriologiska pinnprov

Olika typer av transportsubstrat avsedda för kliniskt bakteriologiska prov tagna med fiberarmerad provtagningspinne finns kommersiellt tillgÀngliga.

Vi anger Amies kolade transportmedium (fabrikat Copan, Brescia, Italien) som referenssubstrat. Provtagningspinnarna Àr försedda med rayon (spunnen cellulosa)-tops och finns i olika grovlekar för olika provlokaler. I certifierad batchprövning ingÄr ett flertal bakteriearter med angiven överlevnadstid för ett flertal bakterietyper pÄ minst 24 timmar.


  • Recept: Amies kolade transportmedium, (Copan, Venturi Transystem, Brescia, Italien)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Charcoal---- 10,0
    • NaCl---- 3,0
    • Na-vĂ€tefosfat---- 1,15
    • K-dikvĂ€vefosfat---- 0,2
    • KCl---- 0,2
    • Na-tioglykollat---- 1,0
    • CaCl2---- 0,1
    • MgCl2---- 0,1
    • Agar---- 4,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

REFERENSER

  • Blomgren E, Larsson M and Sjöberg L.. Comparative study of the bacteriological performance of commercial Amies agar swab transport devices with a traditional Stuart agar transport system. ASM 101st General meeting, Orlando, Florida. 2001. Poster session 29.
  • Eley, A et al. Comparative growth of Bacteroides species in various anaerobic culture media. J Med Microbiol. 1985; 19: 195-201.
  • Ellner, PD et al. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 1966; 45: 502-504.
  • Ganguli, LA et al. Evaluation of fastidious anaerobe broth as a blood culture medium. J Clin Pathol. 1982; 35: 458-461.
  • GĂ€strin B, Kallings L O and Marcetic A. The survival time of different bacteria in various transport media. Acta Path Microbiol Scand. 1968; 74:371-380.
  • Heginbothom, M et al. Comparison of solid media for cultivation of anaerobes. J Clin Pathol. 1990; 43: 253-6.
  • Hunt G and Price, EH. Comparison of a homemade blood culture broth containing a papain digest of liver, with four commercially available
. J. Clin Pathol. 1982; 35: 1142-1149.
  • Kahlmeter G / Smyth R 2000. [2]/MRB
  • Mackey J P and and Sandys G H. Diagnosis of urinary Infections. BMJ. 1966; May: 1173
  • Mason E O et al. Evaluation of four methods for detection of group B streptococcal colonization. J Clin Microbiol. 1976; 4: 429-431.
  • Petts DN. Colistin-oxolinic acid-bloodagar: a new selective medium for streptococci. J Clin Microbiol. 1984; 19: 4-7.
  • Stalons D R et al. Effect of Culture medium an Carbon dioxide concentration on growth of anaerobic bacteria commonly encountered in clinical specimens. Appl Microbiol. 1974; 27: 1098-1104.
  • Thayer J. D. and Martin, J. E. Improved medium selective for cultivation of N. gonorrhoeae of N. meningitidis. Publ Health Reports. 1966; 81: 559-562.
  • Waterworth, P. M. The stimulation and inhibition of the growth of Haemophilus influenzae on media containing blood. B J Exp Pathol. 1955; 36: 186-194.
  • Welch, D. F. et al. Comparative evaluation of selective and nonselective culture techniques for isolation of group A beta-hemolytic streptococci. Am J Clin Pathol. 1991; 95: 587-590.