Bilaga 1 Bakteriologiska substratrecept-NLI

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Nedre luftvÀgsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005


Bakteriologiska substratrecept

De enskilda laboratoriernas substratval följer traditioner baserade pÄ lokala erfarenheter, kunskaper och uppfattningar. Tanken Àr att referenssubstraten skall utgöra valideringsgrund vid det lokala substratvalet. Ett problem vid sÄdana valsituationer Àr att olika fabrikat av ett substrat med synbarligen samma recept (eller olika recept för den delen) kan ha olika egenskaper och fungera mer eller mindre vÀl. Betydande batchvariationer förekommer ocksÄ. Det Àr alltsÄ lÀmpligt att t.ex. inför en upphandling jÀmföra angivet referenssubstrat mot en uppsÀttning av alternativa substrat dÀr det förra inte nödvÀndigtvis Àr det som visar sig ha de bÀsta egenskaperna.

För referenssubstraten anges firmanamn och katalognummer för spÄrbarhet till typrecept. NedanstÄende substratbeskrivningar avseende allmÀn odling av nedre luftvÀgsprov finns ocksÄ i vissa stycken mer utförligt beskrivna i I 1 2:a upplagan 2002 (MacConkeyagar) och I 11 (blodagar, hematinagar, CLED-agar, anaerob blodagar, FAB, TSB och MSA-platta). I I 1 och I 11 finns ocksÄ angivet alternativa beredningsformer eller alternativ för flera av substraten. Samtliga angivna fabrikat av referenssubstrat Àr CE-mÀrkta enligt IVD-direktivet.

1.1. Substrat för allmÀn odling av nedre luftvÀgsprov

Rekommenderade referensstammar och vÀxtkarakteristika för vissa substrat Se I 11, Tabell 14a-c (Blodagar, Hematinagar, CLED-agar, anaerob blodagar, anaerob anrikningsbuljong).


1.1.1 Blodagar

Indikation: Substrat anrikat med hÀstblod för isolering av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer samt olika gramnegativa stavar, Neisseria (ej gonokocker), stafylokocker, pneumokocker och streptokocker frÄn kliniska prov.

Princip: Columbia blodagarbas Ă€r ett vĂ€lkomponerat grundmedium med bland annat kaseinhydrolysat och köttextrakt som kvĂ€ve- och kolhydratkĂ€llor avsett att anvĂ€ndas anrikat med 5-10 % valfritt blod. Vanligen anvĂ€nds 5 % defibrinerat hĂ€stblod vilket ger distinkt betahemolys med olika streptokocker, vissa stammar av enterokocker och Listeria. Defibrinerat hĂ€stblod har ringa tendens att chelera metalljoner och ger ofta frodigare kolonier Ă€n om citratblod anvĂ€nds. MĂ„nga fabrikat av Columbia blodagarbas Ă€r inte avpassade för citratblod vilket ocksĂ„ gĂ€ller referenssubstratet. Betahemolys orsakas av hemolys av de röda blodkropparna medan alfahemolys orsakas av att hemoglobinet i helt eller delvis intakta röda blodkroppar reduceras till methemoglobin. För blodagar avsedd för pĂ„visande av betastreptokocker i svalgodlingar brukar istĂ€llet 5-10 % fĂ„rblod rekommenderas, eftersom exempelvis enterokocker ofta inte ger betahemolys pĂ„ sĂ„dant blod. FĂ„rblod tenderar ocksĂ„ att undertrycka normalflora, sĂ€rskilt Haemophilus, mer Ă€n hĂ€stblod. FĂ„rblodplattor kan gjutas dubbelskiktade för att underlĂ€tta avlĂ€sningen. VĂ€xtkarakteristika: PĂ„ hĂ€stblodagar vĂ€xer de flesta bakteriearter ut inom ett dygn. Kolonistorlek och utseende varierar kraftigt mellan olika arter trots att mediet inte i klassisk bemĂ€rkelse Ă€r differentierande. Flera bakteriearter uppvisar alfa- eller betahemolys, den senare med större sĂ€kerhet om plattorna inkuberas anaerobt. Ett flertal bakterietyper vĂ€xer svagt eller inte alls pĂ„ hĂ€stblodagar. Dit hör bland andra Haemophilus influenzae, Legionella och gonokocker.


Recept: (Columbia blodagarbas, Acumedia no 7125)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pankreasdigererat kasein---- 5,0
  • Köttextrakt---- 8,0
  • JĂ€stanrikad pepton---- 10,0
  • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
  • NaCl---- 5,0
  • Agar---- 14,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C


Bered 5 % blodagar genom tillsats av sterilt, defibrinerat hĂ€stblod (alternativt fĂ„rblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.

1.1.2. Hematinagar (Chokladiserad blodagar)

Indikation: NÀringsberikat medium för isolering av gonokocker, meningokocker och Haemophilus influenzae frÄn kliniska prov. ResistensbestÀmning av gonokocker.

Princip: Gc-agarbasbaserat medium som nÀringsberikas antingen med hemoglobin (torkat nötblod) och IsoVitaleX eller med hemolyserat hÀstblod och hÀstserum. Gc-agarbas utnyttjar som mÄnga andra blodagarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt som kvÀve- och kolhydratkÀlla. Reducerad agarmÀngd och fosfatbuffring bidrar till bÀttre och snabbare vÀxt av framförallt gonokocker. Hemoglobin och IsoVitaleX (liksom lyserat hÀstblod och serum) tillför mediet bland annat X-faktor och V-faktor, en förutsÀttning för vÀxt av H. influenzae, men bidrar ocksÄ till god vÀxt av Neisseria-arter. Hematinagar anvÀnds ocksÄ med tillsats av selekterande antibiotika (Modifierad Thayer-Martin-agar, VCNT-supplement) för isolering av gonokocker frÄn kliniska prov.

VĂ€xtkarakteristika: Meningokocker, gonokocker och Haemophilus vĂ€xer inom ett dygn med ”feta” blanka grĂ„a kolonier, diameter 0,5-2 mm. PĂ„ hematinagar vĂ€xer ocksĂ„ inom ett dygn (ofta med kraftigare vĂ€xt efter tvĂ„ dygn) pneumokocker och streptokocker med tydlig alfahemolys (gĂ€ller inte t.ex. GBS), stafylokocker (vita eller gulgrĂ„a kolonier), Listeria (stora matta platta kolonier) och ett flertal arter av gramnegativa stavar (stora ofta ”rĂ„a” kolonier). Candida albicans vĂ€xer inom ett till tvĂ„ dygn med karakteristiskt ”stjĂ€rn-” formade vita, matta kolonier.


Recept: (Gc-agarbas, Acumedia no 7104)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pankreasdigererat kasein---- 7,5
  • Köttextrakt---- 7,5
  • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
  • Di-kaliumfosfat---- 4,0
  • Mono-kaliumfosfat---- 1,0
  • NaCl---- 5,0
  • Agar---- 10,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C


Tillred hematinagar genom tillsats av hemoglobinpulver 10 g och IsoVitaleX 10,0 mL enligt tillverkarens anvisningar.


Recept: IsoVitaleX (BBL, no 11876)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Vitamin B12---- 0,1
  • L-glutamin---- 10,0
  • Adenin---- 1,0
  • Guanin HCl---- 0,03
  • p-Aminobensoesyra---- 0,013
  • Nikotinamid-adenin-dinukleotid---- 0,25
  • Tiamin pyrofosfat---- 0,1
  • JĂ€rnnitrat---- 0,02
  • Tiamin HCl---- 0,003
  • L-cystein HCl---- 25,9
  • L-cystin---- 1,1
  • D-Glukos---- 100,0

1.1.3 CLED-agar

Indikation: Referenssubstrat för (i första hand) isolering av urinvÀgspatogener frÄn urinprov, och Enterobacteriaceae vid allmÀn odling.

Princip: CLED Àr en förkortning av Cystein-Lactose-Electrolyt-Deficient utvecklat av Sandys och Mackey. Substratet Àr icke-inhibitoriskt men inte lika nÀringsrikt som blodagar. InnehÄller sÄvÀl kaseinhydrolysat som köttextrakt och understödjer dÀrmed vÀxt av ett stort antal kliniskt relevanta bakterietyper. Karakteristiskt för detta substrat Àr avsaknaden av elektrolyter, vilket hindrar svÀrmning i första hand av Proteus. Mindre selektivt men för övrigt funktionellt nÀra saltfri MacConkeyagar. Laktospositiva bakterier blir gula medan laktosnegativa behÄller mediets blÄa grundfÀrg. Kontaminanter frÄn urogenital flora (laktobaciller, mikrokocker och difteroider) vÀxer ofta ut som mikrokolonier pÄ plattan, vilket indikerar förorening.

VÀxtkarakteristika: E. coli och andra gramnegativa bakterier vÀxer inom ett dygn med relativt stora (diameter >2mm), opaka, blanka, slÀta kolonier. Laktospositiva bakterier blir gulfÀrgade, ofta med gult fÀrgomslag i substratet. Grampositiva bakterier som stafylokocker och enterokocker vÀxer med mindre, ofta gula kolonier (diameter 1-2mm). Growth index för de flesta bakterietyper nÀra de för blodagar.


Recept: CLED-agar (enligt Mackey och Sandys, OXOID CM301)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pepton---- 4,0
  • ”Lab-Lemco” pulver---- 3,0
  • Trypton---- 4,0
  • Laktos---- 10,0
  • L-cystein---- 0,128
  • BromtymolblĂ„tt---- 0,02
  • Agar---- 15,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C


1.1.4 Anaerob blodagar (FAA)

Indikation: Substrat avsett för primÀr isolering av flera typer av kliniskt relevanta anaeroba bakterier frÄn kliniska prov.

Princip: Fastidious anaerobe agar (FAA) Ă€r en i grunden vĂ€l balanserad blodagarbas med speciell peptonmix som kvĂ€ve- och frĂ€msta kolhydratkĂ€lla. Mediet innehĂ„ller stĂ€rkelse och bikarbonat vilka bĂ„da neutraliserar toxiska metaboliter. FAA innehĂ„ller ocksĂ„ hemin och vitamin K, vilka utgör tillvĂ€xtfaktorer för ett flertal arter av anaeroba bakterier. Cystein sĂ€nker redoxpotentialen och pyruvat bidrar till neutralisering av vĂ€teperoxid. Substratet förstĂ€rks med 5 % hĂ€stblod, vilket förutom att bidra med ytterligare tillvĂ€xtfaktorer ocksĂ„ möjliggör bedömning av hemolys.

VĂ€xtkarakteristika: Se I 11 bilaga 3, tabell 14.


Recept: Fastidious anaerobe agar (FAA, LABM Lab 90)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Peptonmix---- 23,0
  • NaCl---- 5,0
  • StĂ€rkelse---- 1,0
  • Agar no 2---- 12,0
  • Na-bikarbonat---- 0,4
  • Glukos---- 1,0
  • Na-pyruvat---- 1,0
  • Cystein HCl monohydrat---- 0,5
  • Hemin---- 0,01
  • Vitamin K (menadion)---- 0,001
  • L-arginin---- 1,0
  • Pyrofosfat---- 0,25
  • Na-succinat---- 0,5

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C


Tillred 5 % anaerob blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hĂ€stblod enligt tillverkarens anvisningar. Vid utvidgad anaerob diagnostik Ă€r bruk av selektiv anaerob blodagar referensmetod. FAA och andra medier kan göras selektiva för anaeroba bakterier genom antibiotikatillsats. Traditionellt anvĂ€nds ofta sĂ„ kallad kanamycin (75 – 100 mg/L) –vankomycin (7,5 mg/L) –agar (referenssubstrat). Denna Ă€r selektiv för Bacteroides fragilis-gruppen och ocksĂ„ lĂ€mpad för isolering av pigmenterade Prevotella species. Det skall dock observeÂŹras att flera Bacteroides-arter, Wolinella, fusobakterier, Bilophila och Porphyromonas liksom grampositiva anaerober ej vĂ€xer pĂ„ detta selektiva substrat.

FAA med tillsats av neomycin, 100 mg/L, (referenssubstrat) Àr sÀrskilt lÀmpad för isolering av klostridier. Den inhiberar Enterobacteriaceae, men ocksÄ vissa gramnegativa anaerober.

1.1.5 Anaerob anrikningsbuljong (FAB)

Indikation: För anrikning av ett stort antal kliniskt relevanta aeroba och anaeroba bakterier frÄn kliniska prover och eventuellt transport av kliniska prover.

Princip: FAB Àr ett mycket nÀringsrikt substrat baserat pÄ speciell peptonmixtur som kvÀve- och kolhydratkÀlla och med jÀstextrakt som nÀringstillskott. L-cystein och Na-tioglykollat bidrar till att reducera buljongen. SmÄ mÀngder agar bidrar till att bibehÄlla anaerobios (redoxindikator resazurin, rosa fÀrgomslag i översta buljongskiktet indikerar aerob miljö dÀr, men för övrigt anaerob miljö i röret). Till skillnad frÄn andra tioglykollatbuljonger och CM-buljong Àr hemin och menadion tillsatta redan till grundberedningen. Trots goda egenskaper uppvisar FAB liksom övriga anaeroba buljongtyper ofta svag vÀxt av fusobakterier och anaeroba grampositiva kocker, vilka kan krÀva tre till sju dygns inkubationstid.

Recept: Tioglykollatbuljong-FAB (LabM, LAB 71 )

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Peptonmixtur---- 5,0
  • JĂ€stextrakt---- 10,0
  • NaCl---- 2,5
  • L-cystein---- 0,5
  • Na-tioglykollat---- 0,5
  • Agar no 1---- 0,75
  • Resazurin---- 0,001
  • Na-bikarbonat---- 0,4
  • Hemin---- 0,005
  • Vitamin K (menadion)---- 0,0005

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C






1.2 Selektiva substrat för Pseudomonas, Burkholderia, Bordetella och Legionella

1.2.1 Pseudomonas aeruginosa

För selektiv isolering av Pseudomonas aeruginosa frÄn kliniska prov finns ett antal kommersiellt utvecklade substrat tillgÀngliga. Dessa baseras frÀmst pÄ gelatininnehÄllande pepton och glycerol samt tillsats av kalium, magnesium och sulfat för att understödja pyocyaninproduktion, en egenskap unik för P. aeruginosa (King et al, 1954). Medierna tillÄter ocksÄ god fluoresceinproduktion, en egenskap som dock inte Àr unik för Pseudomonas. Selektivitet för P. aeruginosa erhÄlles genom tillsats av cetrimid (cetyl trimetyl ammoniumbromid, i vissa beredningsformer i reducerad mÀngd tillsammans med andra antimikrobiella substanser som nalidixinsyra, cefalotin och fusidinsyra (de tvÄ senare medlen i kombination ger selektivitet för Pseudomonas sensu stricto).


Cetrimidagar

Indikation: Referenssubstrat för selektiv isolering av Pseudomonas aeruginosa i kliniska luftvÀgsprover, i första hand frÄn patienter med cystisk fibros. PÄvisande av pyocyanin- (och fluorescein-) produktion hos P. aeruginosa. Agartypen rekommenderas i sÄvÀl europisk som amerikansk farmakopé.

Princip: Substratet baseras pĂ„ King’s A-medium som komponerades för att differentiera P. aeruginosa-isolat frĂ„n andra bakterier. Detta Ă„stadkoms genom mediets innehĂ„ll av magnesium, kalium och sulfat vilka stimulerar pyocyaninbildningen. Typiska kolonier blir grönblĂ„aktiga och omges av en blĂ„grön pigmentskiftning i mediet, orsakad av den kombinerade effekten av pyocyanin och pyoverdin (fluorescein). Vissa stammar av P. aeruginosa producerar ocksĂ„ andra typer av pigment som pyorubin, eller pyomelanin. Ibland kan dessa pigment ta överhanden och maskera pyocyanin vilket resulterar i gulvita, rödaktiga eller brunaktiga kolonier. NĂ„gra procent av P. aeruginosa-stammar producerar inget pigment, varvid kolonierna blir ofĂ€rgade. SĂ€rskilt prevalent Ă€r detta bland de mukoida stammar som isoleras frĂ„n CF-patienter.

Bromföreningen cetrimid Ă€r toxisk för de flesta bakteriearter med undantag av nĂ„gra arter inom gruppen Psedomonas sensu stricto. SĂ€rskilt Ă€r P. aeruginosa och P. fluorescens resistenta, men ca 6-10 % av isolaten Ă€r kĂ€nsliga för cetrimid.

VĂ€xtkarakteristika: PĂ„ cetrimidagar som Ă€r blekt gulvit och genomskinlig vĂ€xer P. aeruginosa CCUG 551 med platta, rĂ„a, 1-3 mm stora grönaktiga stĂ€llvis metallglĂ€nsande kolonier i 37 °C (och 41 °C) inom 24 timmar. Kolonierna omges av grönblĂ„ fĂ€rgskiftning i mediet. Mukoida stammar vĂ€xer utan omslag i mediet. Samtidig förekomst av mycket smĂ„ kolonier Ă€r typiskt. Growth index relativt blodagar drygt 50 %.

Referensstammarna av B. cepacia genomovar I och II och Pandoraea spp vÀxer med ofÀrgade till vitgula kolonier. Enstaka kolonier av Stenotrophomonas maltophilia och Citrobacter braakii kan ocksÄ vÀxa fram efter förlÀngd inkubering till 48 tim. Burkholderia gladioli, Achromobacter xylosoxidans och Ralstonia pickettii vÀxer mycket svagt eller inte alls.

Recept: Cetrimidagar (Difco, No. 285420)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pankreasdigererat gelatin---- 20,0
  • Magnesiumklorid---- 1,4
  • Kaliumsulfat---- 10,0
  • Cetrimid---- 0,3
  • Agar 13,6

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

  • Kontrollstammar
    • P. aeruginosa CCUG 551,
    • E. coli CCUG 17620.

Alternativt substrat för selektiv isolering av P. aeruginosa: Ett ofta anvÀnt alternativt substrat, liksom referenssubstratet baserat pÄ KingŽs A-medium, Àr Pseudomonas isolation agar dÀr cetrimid bytts mot den brett antimikrobiella substansen Irgasan (finns ocksÄ i t.ex. CIN-agar för selektiv isolering av Yersinia). Egenskaper för övrigt likvÀrdiga cetrimidagar.


Recept: Pseudomonas isolation agar (Difco, No 292710.)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pepton---- 20,0
  • Magnesiumklorid---- 1,4
  • Kaliumsulfat---- 10,0
  • Irgasan---- 25,0
  • Agar---- 13,6

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillreds enligt tillverkarens anvisningar.


REFERENSER

  • King, B.S., Ward, M.K.W. & Roney, D.E. 1954. J Lab Clin Med. 44:301.



1.2.2 Burkholderia cepacia-komplexet

Eftersom kolonisering av luftvĂ€garna med Burkholderia cepacia-bakterier fĂ„r omfattande konsekvenser för CF-patienterna, Ă€r det av stor betydelse att förutsĂ€ttningarna för isolering frĂ„n luftvĂ€gssekret Ă€r optimerade. Gilligan och medarbetare utvecklade ett medium för Ă€ndamĂ„let med bland annat tikarcillin och polymyxin B som selektiva komponenter, vilket vĂ€sentligen förbĂ€ttrade sĂ„vĂ€l sensitivitet som specificitet framför MacConkeyagar som tidigare varit vanlig för primĂ€r isolering av B. cepacia (Gilligan et al, 1985). PĂ„ grund av mediets goda selektiva egenskaper innefattande undertryckandet av de flesta Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. och Stenotrophomonas maltophilia, har det kommit till utbredd anvĂ€ndning. I dag anvĂ€nds ofta ett nĂ„got modifierat substrat, ”MASTs Burkholderia selective agar” vilket nedan anges som referenssubstrat. Ett substrat, utvecklat av Henry och medarbetare (1997) rekommenderas i ASM-manualen, Ă„ttonde upplagan, och har nyligen blivit kommersiellt tillgĂ€ngligt. Detta (BCSA) anges nedan som alternativt substrat och har i en ny studie jĂ€mförts mot MASTs substrat och befunnits vara vĂ€l sĂ„ bra som detta, t. o. m. med nĂ„got snabbare tillvĂ€xt av mĂ„lbakterien.

Indikation: För selektiv isolering av Burkholderia cepacia-komplexet frÄn kliniska luftvÀgsprover, i första hand frÄn patienter med cystisk fibros.

Princip: Referenssubstratet Àr en modifierad variant av Gilligans ursprungliga formulering. Det har en vÀlbalanserad komposition med oorganiska salter och pepton för snabb tillvÀxt av mÄlbakterien. Selektivitet för B. cepacia-komplexet uppnÄs genom gallsalter, kristallviolett och antimikrobiella medel (tikarcillin och polymyxin B). Trots dessa selektiva komponenter vÀxer mÄlbakterierna i princip lika bra som pÄ fÄrblodagar, och lika bra eller bÀttre Àn pÄ MacConkeyagar. Genomslag av övrig flora Àr ringa, men kan förekomma med jÀstsvamp, P. aeruginosa, Alcaligenes spp och Pandoraea spp.

VÀxtkarakteristika: MÄlbakterierna vÀxer frÄn 24 tim upp till 5 dygn, varvid majoriteten inom 48 tim, med 1-2 mm stora vita eller gulgrÄ kolonier, efter nÄgra dygn ibland med metalliskt inslag. Kolonierna omges av ett rosa omslag i mediet. Det skall observeras att olika genomovarianter av B. cepacia vÀxer olika bra, sÄledes vÀxer referensstammen B. multivorans (genomovar. II) oftast med endast ringa vÀxt. Detsamma gÀller Burkholderia gladioli, Achromobacter xylosoxidans och Ralstonia pickettii.


Recept: (MASTs Burkholderia selective agar, “Cepaciaplattor” MAST Diagnostics DM 253)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Magnesium sulfat---- 0,2
  • JĂ€rn-ammoniumsulfat---- 0,01
  • Kalium dihydrofosfat---- 4,35
  • Di- Na –vĂ€tefosfat---- 1,42
  • Gallsalter---- 0,5
  • Agar A (RM10)--- 12,0
  • Ammoniumsulfat---- 1,0
  • Peptonblandning---- 8,0
  • Kristallviolett---- 0,001
  • Fenolrött---- 0,02
  • Na-pyruvat---- 5,0

pH 6,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred Burkholderia selective agar enligt tillverkarens anvisningar och tillsÀtt tikarcillin, slutkonc. 100 mg/L och polymyxin B, slutkonc. 300.000 U/L.

  • Kontrollstammar
    • Burkholderia cepacia CCUG 12691,
    • P. aeruginosa CCUG 551,
    • E. coli CCUG 17620.



Alternativt substrat för selektiv isolering av B. cepacia-komplexet: Ett substrat som senare jÀmförts mot Gilligans ursprungliga medium och Àven mot referenssubstratet (MAST DM 253) utvecklades i USA av D.A. Henry och medarbetare (BCSA, Henry et al. 1997). Detta substrat har vÀl sÄ bra sensitivitet för mÄlorganismerna som referenssubstratet, framförallt i form av snabbare vÀxt, men ocksÄ bÀttre specificitet med genomslag av fÀrre kontaminanter ur luftvÀgsfloran. B. gladioli vÀxer nÄgot bÀttre pÄ BCSA Àn pÄ Gilligans medium. DÀremot kan vissa grampositiva kocker som E. faecalis slÄ igenom pÄ BCSA. Substratet rekommenderas i senaste ASM-manualen, och har nyligen blivit kommersiellt tillgÀngligt.

Recept: Burkholderia cepacia selective agar (BCSA) enligt Henry och medarbetare.

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Trypticase pepton---- 10,0
  • NaCl---- 5,0
  • Sackaros---- 10,0
  • Laktos---- 10,0
  • Fenolrött---- 0,08
  • Kristallviolett---- 0,002
  • JĂ€stextrakt---- 1,5
  • Agar (BD)---- 14,0

pH 6,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred substratet med tillsats av följande selektiva substanser: Polymyxin B, slutkonc. 600.000 U/L, gentamicin 10 mg/L och vankomycin 2,5 mg/L.


REFERENSER

  • Henry, D.A., et al. 1997. Identification of Burkholderia cepacia isolates from patients with cystic fibrosis and use of a single new selective medium. J Clin. Microbiol. 35:614-619.
  • Wright, R.M., et al. 2001. Improved cultural detection of Burkholderia cepacia from sputum in patients with cystic fibrosis. J. Clin. Pathol. 54:803-805.
  • Gilligan, P.H., et al. 1985. Isolation medium for the recovery of Pseudomonas cepacia from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 22:5-8.
  • Gilligan, P H et al. Burkholderia, Stenotrophomonas etc. In Manual of Clinical Microbiology, 8 th edition. Chapter 48, Vol. 1; 729-748.


1.2.3 Bordetella pertussis och parapertussis

För nÀra 100 Är sedan utvecklade Bordet och Gengou ett substrat för isolering av Bordetella baserat pÄ potatisstÀrkelse och fÄrblod. Detta substrat fick omfattande spridning och har först under senare decennier ersatts av ett annat likvÀrdigt (Charcoalagar) men med betydligt lÀngre hÄllbarhet. De bÄda substraten anvÀnds pÄ vissa laboratorier parallellt.

Charcoalagar med hÀstblod och cefalexin

Indikation: För selektiv isolering av Bordetella pertussis/parapertussis frÄn nasofarynxprov.

Princip: Medium utvecklat för odling av B. pertussis/parapertussis och H. influenzae, frĂ„n början utan blodtillsats för odling inför tillverkning av kikhostevaccin. För kliniskt bruk har mediet senare optimerats genom tillsats av 10 % hĂ€stblod och cefalexin, 40 mg/L (Regan & Lowe, 1977, avser ocksĂ„ anrikningsmedium med halva substratmĂ€ngden). I det fasta referenssubstratet ingĂ„r helblod i stĂ€llet för lyserat blod som ofta anvĂ€ndes till anrikningsmediet. Dessutom ingĂ„r nikotinsyra som Ă€r en essentiell tillvĂ€xtfaktor för Bordetella. Ett huvudproblem vid isolering av B. pertussis frĂ„n nasofarynxsekret Ă€r undertryckandet av annan flora pĂ„ plattorna under den lĂ„nga inkubationstiden. Bland det flertal selektiva substanser som prövats har cefalexin utkristalliserats som den i sammanhanget mest effektiva. Val av cefalexin i stĂ€llet för t.ex. penicillin eller meticillin innebĂ€r ocksĂ„ att mediets hĂ„llbarhet förlĂ€ngts avsevĂ€rt. Endast Pseudomonas och vissa svampar slĂ„r igenom pĂ„ substratet.

VĂ€xtkarakteristika: Efter ca 3 dygn upptrĂ€der B. pertussis som mycket smĂ„ grĂ„, konvexa, opaka skinande kolonier som ser ut som ”kvicksilverdroppar”. B. parapertussis vĂ€xer med större (ca 1 mm) kolonier, blanka med ljust brunrosa fĂ€rg.

H. influenzae vÀxer med mycket smÄ, vattendroppslika kolonier. Grampositiva kocker vÀxer ej. P. aeruginosa vÀxer med ca 5 mm stora platta grön-rosa kolonier. Candida albicans vÀxer med torra rÄa rosaskiftande kolonier, ca 1 mm stora.

Recept: Charcoalagar (OXOID, CM119) med 10 % hĂ€stblod och cefalexin 40 mg/L

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • LabLemco pulver---- 10,0
  • Pepton---- 10,0
  • Bakteriologiskt kol---- 4,0
  • NaCl---- 5,0
  • Nikotinsyra---- 0,001
  • Agar---- 12,0

pH 7,4 ± 0,2 vid 25 °C

Bered selektiv pertussisagar genom tillsats av 10 % defibrinerat hĂ€stblod och cefalexin 40 mg/L.

  • Kontrollstammar
    • Bordetella pertussis CCUG 34132,
    • B. parapertussis CCUG 413,
    • Bordetella pertussis CCUG 34133 (svagvĂ€xande variant),
    • S. aureus CCUG 17621.


Transport- och anrikningsmedium för B. pertussis

För detta Ă€ndamĂ„l anvĂ€nds charcoalagar beredd till halva styrkan (Regan and Lowe, 1977). DĂ€refter tillsĂ€ttes 10 % defibrinerat lyserat hĂ€stblod och cefalexin till 40 mg/L.


Alternativt substrat för isolering av B. pertussis/parapertussis frÄn nasofarynxprov

Bordet-Gengou agar med helblod erbjuder ett alternativ till charcoalagar. Substratet utvecklades redan 1906 men har sedan dess modifierats, bland annat genom tillsats av högvÀrdig pepton. Detta utelÀmnades i den ursprungliga formuleringen för att göra mediet i viss mÄn selektivt. Baseras för övrigt pÄ potatisstÀrkelse som vid tiden var populÀr som bas i fasta medier. B. pertussis vÀxer inom 3-4 dygn med mycket smÄ, konvexa pÀrlemorskimrande kolonier omgivna av en smal zon med betahemolys. De skiljer sig distinkt frÄn B. parapertussis och B. bronchiseptica som vÀxer med bruna pigmenterade kolonier. Mediet Àr kÀnsligt för uttorkning och har kort hÄllbarhet. Har anvÀnts speciellt för bedsideodling. Idag torde anvÀndningsomrÄdet inskrÀnka sig till subkultur efter anrikning i Regan-Lowes anrikningsmedium. DÀrvid har mediet visats vara likvÀrdigt med charcoalagar (Kurzynski et al. 1988).

Recept: Bordet-Gengou agar bas (OXOID CM267) med glycerol, hÀstblod och cefalexin

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Infusion av potatis---- 4,5
  • Proteose pepton---- 10,0
  • NaCl---- 5,5
  • Agar---- 16,0


Bered Bordet-Gengouagar genom tillsats av 1 % glycerol i destillerat vatten. TillsĂ€tt 15-20 % defibrinerat hĂ€stblod och cefalexin 40 mg/L. Mediet Ă€r ljust körsbĂ€rsrött och bör anvĂ€ndas omedelbart eller lagras fuktigt under upp till en vecka. De skall inte anvĂ€ndas om den ursprungliga fĂ€rgen förĂ€ndrats.


REFERENSER

  • Bordet, J., and Gengou, O. 1906. Le microbe de la coqueluche. Ann Inst. Pasteur. 20:731-741.
  • Regan, J., and Lowe, F. 1977. Enrichment medium for the isolation of Bordetella. J. Clin. Microbiol. 6: 303-309.
  • MĂŒller, F-M.C. et al. 1977. Minireview. Laboratory diagnosis of pertussis: State of the art in 1977. J. Clin. Microbiol. 35: 2435-2443.
  • Kurzynski, T.A., et al. 1988. Comparison of modified Bordet-Gengou and modified Regan-Lowe media for the isolation of B. pertussis/parapertussis. J. Clin. Microbiol. 26:2661-2663.


1.2.4 Legionella

Odlingsdiagnostiken av Legionella spp baseras pĂ„ specialkomponerade fasta substrat som kan göras selektiva med sĂ€rskilda tillsatser. Vanligen anvĂ€nds BCYE-agar (referenssubstrat) efter EdelsteinÂŽs formulering frĂ„n 1981, vilken innehĂ„ller aktiverat kol, jĂ€stextrakt och för Legionella essentiella vĂ€xtfaktorer som L-cystein och ïĄ-ketoglutarsyra. Selektivitet uppnĂ„s genom tillsats av bland annat vankomycin, polymyxin B och anisomycin (MWY-medium, selektivt referensÂŹsubstrat).

Buffered charcoal yeast extract agar (BCYEïĄ-agar)

Indikation: För isolering av Legionella species frÄn kliniska luftvÀgsprov.

Princip: BCYE-agar innehÄller jÀstextrakt som proteinkÀlla, L-cystein, jÀrnpyrofosfat och alfa-ketoglutarsyra, de tre sista komponenterna essentiella för Legionella spp. som jÀrnkÀlla och vid omsÀttningen av aminosyror. Aktiverat kol inaktiverar toxiska metaboliter som vÀteperoxid och binder koldioxid. Kolet sÀnker ocksÄ ytspÀnningen vilket underlÀttar mikrobiell profilering. ACES buffert liksom KOH (i stÀllet för NaOH dÄ Na Àr toxiskt för Legionella) bevarar effektivt optimalt pH.

Vid beredningen av BCYE-agar kan ett identiskt medium dÀr L-cystein utelÀmnas (ej referenssubstrat) tillverkas. Detta understödjer inte vÀxt av Legionella och kan anvÀndas som parallell odlingskontroll.

BCYE-agar kan göras selektiv för Legionella spp. genom tillsats av polymyxin B, anisomycin, vankomycin och glycin. Samtidigt tillsÀttes bromkresolpurpur och bromtymolblÄtt för infÀrgning av Legionella (modifierad Wadowsky and Yee Medium, MWY-(medium, referenssubstrat).

VÀxtkarakteristika: Legionella spp. vÀxer pÄ BCYE-agar och MWY-medium men inte pÄ cysteinfritt medium, blodagar, hematinagar eller CLED-agar. Legionella vÀxer inom 2-3 dygn med 1-2 mm stora vita blanka/mukoida kolonier, pÄ MWY med vit-gröna (L. pneumophila) till blÄ-gröna kolonier. Se för övrigt under Legionella i speciella delen av denna bok.

Recept: BCYE-agar. (Referenssubstrat anges ej men kommersiellt tillgÀngliga halvfabrikat och supplement finns)

  • JĂ€stextrakt DIFCO alternativt BBL---- 10,0 g
  • Activated charcoal, Norit A eller Merck 2184 ---- 1,5 g
  • Löst i destillerat vatten och autoklaverat separat.
  • ACES buffert, Sigma---- 10,0 g
  • K-salt av α-ketoglutarsyra, Sigma---- 1,0 g

pH justeras till 6,85-6,95 med KOH. Observera att detta mÄste ske före tillsats av agar, eftersom glutarsyra och ACES buffert bÄda Àr mycket sura.

  • Agar, Bactoagar, DIFCO ---- 17,0 g
  • Dest. vatten ---- ad 1000 mL

Autoklaveras vid 120 °C i 20 min, kyles dÀrefter till 50 °C.

Efter avsvalning tillsÀtts:

  • L-cystein HCL H2O, löst i 10 mL dest vatten---- 0,4 g
  • ferric pyrophosphate soluble, löst i 10 mL dest. vatten---- 0,25 g

Recept: MWY Medium (selektivt supplement till Legionella agar bas, finns kommersiellt tillgÀngligt)

  • Tillsats till ovanstĂ„ende medium, till 100 mL berĂ€knas:
    • Glycin---- 0,3 g
    • Vankomycin---- 0,1 mg
    • Polymyxin ---- 5000 U
    • Anisomycin---- 8 mg
    • BromtymolblĂ„tt---- 1 mg
    • Bromkresolpurpur ---- 1 mg

1 AnvÀnds för att hÀmma ev svampvÀxt. Anisomycin Àr dyrt och kan uteslutas i rutin, men det bör finnas en beredskap att anvÀndas vid behov.

  • Sterilfiltreras

Plattorna Àr hÄllbara 3 veckor under mörk plast i 4 °C.

  • Kontrollstammar
    • Legionella pneumophila CCUG 9568,
    • Legionella (Fluoribacter) bozemanii CCUG 11880.


REFERENS

  • Edelstein, P.H. 1981. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental specimens. J. Clin. Microbiol. 14:298-303.