Bilaga 1a. Bakteriologiska referenssubstrat

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002


Substratbeskrivningar

Salmonella/Shigella substrat

Bilaga 1.1.1


XLD-agar (Xylose-Lysin-Desoxycholat agar)

Indikation: PrimÀrisolering av Salmonella och Shigella frÄn humana fecesprov, samt utodling av Salmonella efter anrikning i buljong.

Princip: VĂ€ldefinierat substrat för isolering av Salmonella- och Shigella-bakterier. Substratets grundfĂ€rg Ă€r röd. Natriumdesoxycholat (1-2,5 gram/L) ger mediet mĂ„ttlig selektiva egenskaper (sĂ€rskilt hĂ€mmas grampositiva bakterier, men dessutom förhindras svĂ€rmning av Proteus species), utan att hĂ€mma Salmonella- eller Shigella-bakterier i nĂ„gon högre grad. Indikatorsystemet utnyttjar de pH-förĂ€ndringar som uppstĂ„r vid olika grader av syraproduktion frĂ„n sockerfermentation (laktos, xylos, sackaros) och samtidig alkaliproduktion genom lysindekarboxylation. Shigella, Proteus och Pseudomonas producerar varken syra eller alkali i systemet och vĂ€xer dĂ€rför i fĂ€rglösa semiopaka kolonier (kolonierna framstĂ„r som röda mot mediets grundfĂ€rg). Salmonella-bakterier Ă€r oftast LD-positiva men kan bara fermentera xylos, vilket ger en övervĂ€gande basisk reaktion. Övriga koliforma bakterier vĂ€xer med gula eller vita opaka kolonier p.g.a. sĂ€nkt pH vid fermentation av laktos och sackaros.

Produktion av H2S kan inte förekomma i sur miljö, varför sÄdan produktion enbart detekteras för vissa bakterietyper (företrÀdesvis Salmonella, Proteus, Edwardsiella och Citrobacter) och ger dÀrvid upphov till centralt svarta kolonier. Observera att vid inkuberingstider > 24 tim kan mediets egenskaper förÀndras, och dÀrmed pÄverka differentierande kolonikarakteristika.

VĂ€xtkarakteristika: Salmonella-bakterier vĂ€xer inom ett dygn som regel med growth index (GI) jĂ€mfört mot blod eller CLED-agar överstigande 50 %. Kolonierna Ă€r semiopaka, slĂ€ta, blanka och fĂ€rglösa (framstĂ„r röda mot mediets grundfĂ€rg). Kolonierna Ă€r ofta stora med diameter >2 mm och har ett distinkt svart centrum. Observera att atypiska LD-negativa eller laktosjĂ€sande Salmonella, i likhet med andra koliforma bakterier, kan vĂ€xa med gulfĂ€rgade, opaka kolonier. Observera att S. Typhi sĂ€llan blir H2S-positiv pĂ„ XLD. Shigella-bakterier vĂ€xer inom ett dygn med semiopaka, slĂ€ta och blanka fĂ€rglösa kolonier (framstĂ„r röda mot mediets grundfĂ€rg). RĂ„a kolonier med ojĂ€mna kanter kan förekomma. Shigella vĂ€xer i allmĂ€nhet med lĂ€gre GI Ă€n Salmonella, vissa stammar vĂ€xer inte alls. Yersinia-arter vĂ€xer inom ett (tvĂ„) dygn med relativt smĂ„ kolonier (0,5-2 mm diameter). Kolonierna Ă€r opaka och gul/vita.

XLD-plattor hÀmmar vÀxt av E. coli och enterokocker ofta med en faktor > 10^3. SÀrskilt Proteus-, Citrobacter-, Pseudomonas- och Aeromonas-arter hÀmmas dock endast i ringa mÄn jÀmfört med icke inhibitoriska media. Den mÄttliga hÀmningen av normalfloran riskerar att maskera vÀxt av mÄlbakterierna, varför substratet inte lÀmpar sig som enda substrat för primÀrisolering. DÀremot Àr substratet vÀl lÀmpat för utodling efter buljonganrikning.


Recept: (XLD-agar, Acumedia no 7166)

  • InnehĂ„ll--- Gram/L
  • Xylos--- 3,5
  • L-lysin--- 5,0
  • Laktos--- 7,5
  • Sackaros--- 7,5
  • NaCl--- 5,0
  • JĂ€stextrakt--- 3,0
  • Fenolrött--- 0,08
  • Agar No 2--- 12,0
  • Natriumdesoxycholat--- 2,5
  • Natriumtiosulfat--- 6,8
  • Ferriammoniumsulfat--- 0,8

pH 7,4 + 0,2



Bilaga 1.1.2


DC-agar enligt HynesÂŽ modifikation (desoxycholat, citrat, laktos-agar)

Indikation: För primÀrisolering av Salmonella och Shigella frÄn humana fecesprov.

Princip: JĂ€mfört med Leifsons DC-agar ger HynesÂŽ modifierade DC-agar effektivare inhibition av normalflora utan att negativt pĂ„verka vĂ€xt av Salmonella och Shigella. Substratets grundfĂ€rg Ă€r blekt ”aprikosröd”. Substratet har goda selektiva egenskaper. En relativt hög koncentration av natriumdesoxycholat (5 gram/L) och natriumcitrat (8,5 gram/L) ger en effektiv inhibition av flertalet bakterier ur normalfloran. Indikatorsystem innefattar laktos och neutralrött. Natriumtiosulfat och jĂ€rnammoniumcitrat utgör indikatorer för H2S-produktion. Laktosfermenterande koliforma bakterier producerar syra, vilket resulterar i rosa/röda opaka kolonier, ofta med en opak zon i mediet p.g.a. utfĂ€llda gallsalter. Sent laktospositiva eller laktosnegativa bakterier blir blekt rosa/röda eller fĂ€rglösa, ibland kan en gul-orange zon i mediet förekomma beroende pĂ„ en basisk reaktion. H2S-producerande bakterier kan ha grĂ„tt eller svart kolonicentrum.

VĂ€xtkarakteristika: Salmonella-bakterier vĂ€xer inom tvĂ„ dygn med GI överstigande 50 % jĂ€mfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall. Kolonierna Ă€r dĂ€rvid semiopaka, blanka, fĂ€rglösa, och mer Ă€n hĂ€lften av fallen med grĂ„tt eller svart centrum. De flesta stammarna vĂ€xer ut redan inom ett dygn. Kolonidiametern Ă€r ofta mindre Ă€n motsvarande pĂ„ XLD. Shigella-bakterier vĂ€xer inom tvĂ„ dygn (ca 1/3 av stammar har inte vĂ€xt ut efter ett dygn) med relativt lĂ„ga GI-vĂ€rden, ofta mindre Ă€n 50 %, upp till 20 % av stammar som vĂ€xer pĂ„ icke inhibitoriskt substrat eller pĂ„ XLD uppvisar mycket dĂ„lig eller ingen vĂ€xt. Kolonierna Ă€r semiopaka, slĂ€ta eller rĂ„a, fĂ€rglösa (ibland rosa/röda opaka). Centralt upphöjda (”stekt Ă€gg”) kolonier förekommer. Yersinia-bakterier (Y. enterocolitica och vissa stammar av Y. pseudotuberculosis, men Ă€ven andra icke humanpatogena Yersinia-bakterier) vĂ€xer inom tvĂ„ dygn med smĂ„ kolonier med ungefĂ€r samma GI som Shigella. Kolonierna Ă€r fĂ€rglösa, ibland blekt rosa/röda. E. coli och enterokocker hĂ€mmas ofta med en faktor >10^3. Proteus-, Citrobacter-, Aeromonas-, Plesiomonas-och Pseudomonas-arter kan vĂ€xa, om Ă€n i mindre omfattning Ă€n pĂ„ XLD-agar. Proteus uppvisar ofta grĂ„tt eller svart kolonicentrum. Den kraftigare hĂ€mningen av normalfloran jĂ€mfört med XLD gör substratet till ett bra komplement vid primĂ€rdiagnostiken, trots den lĂ€gre sensitiviteten för mĂ„lbakterierna, sĂ€rskilt Shigella.

Recept: (DC-agar enligt Hynes, Oxoid CM227)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • ÂŽLab-LemcoÂŽ pulver---- 5,0
  • Pepton---- 5,0
  • Laktos---- 10,0
  • Natriumcitrat---- 8,5
  • Natriumtiosulfat---- 5,4
  • JĂ€rnammoniumcitrat---- 1,0
  • Natriumdesoxycholat---- 5,0
  • Neutralrött---- 0,02
  • Agar---- 12,0

pH 7,3 + 0,2



Bilaga 1.1.3

Andra agarbaserade substrat för isolering av Salmonella/Shigella

OvanstÄende agarmedier utgör referenssubstrat vid diagnostik av Salmonella- och Shigella-bakterier. Bland övriga pÄ marknaden förekommande fasta substrat som ibland anvÀndes kan nÀmnas:

Hektoen-agar Àr lika selektiv och för övrigt med egenskaper pÄminnande om XLD. Med detta avses bl.a. att Salmonella-, Shigella- och Yersinia-bakterier vÀxer med ungefÀr samma GI pÄ dessa substrat som pÄ XLD. Substratet Àr dock mindre vÀldokumenterat Àn XLD och DC-agar. Substratet har en grön grundfÀrg. Hög peptonhalt. AnvÀnder gallsalter för hÀmning av normalflorans bakterier. Understödjer vÀxt av sÄvÀl Salmonella- som Shigella-bakterier. Salmonella vÀxer med gröna kolonier med eller utan svart centrum. Shigella vÀxer med gröna, genomskinliga ofta platta kolonier. Yersinia och koliforma bakterier vÀxer med laxröda till oranga kolonier, ofta omgivna av en opak zon i mediet (utfÀllda gallsalter). Acceptabelt som alternativ till i första hand XLD-agar.


Recept: (Hektoen-agar, Oxoid CM419)

Hektoenagar med Salmonella-kolonier Bild:Wikimedia Commons; licens Creative Commons Attribution-Share Alike 2.0 France


  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Proteospepton---- 12,0
  • JĂ€stextrakt---- 3,0
  • Laktos---- 12,0
  • Sackaros---- 12,0
  • Salicin---- 2,0
  • Gallsalter---- 9,0
  • Natriumklorid---- 5,0
  • Natriumtiosulfat---- 5,0
  • AmmoniumjĂ€rncitrat---- 1,5
  • Fuchsin---- 0,1
  • BromtymolblĂ„tt---- 0,065
  • Agar---- 14,0

pH 7,5 + 0,2


Salmonella/Shigella-agar (SS-agar). Komposition och egenskaper hos detta substrat ungefÀr som DC-agar men utnyttjar egenskaper hos gallsalter, citrat och brilliantgrönt för att hÀmma normalflora. Salmonella-och flertalet Shigella- (men inte alla) stammar vÀxer i fÀrglösa kolonier. De förra fÄr ofta grÄtt/svart centrum. Laktospositiva bakterier blir rosafÀrgade. OsÀker vÀxt av Shigella och Àven Yersinia. Substratet torde inte erbjuda nÄgra fördelar framför DC-Hynes, och erbjuder dÀrtill osÀkrare vÀxt av Shigella.

Brilliantgrön-agar. Avsedd för isolering av Salmonella-bakterier (dock ej S. Typhi), men p.g.a. relativt hög koncentration av brilliantgrönt (0,005-0,03 gram/L) ej för Shigella-bakterier frÄn t.ex. fecesprov.



Bilaga 1.1.4


Anrikningsbuljonger (Observera att inga bra buljonger finns för anrikning av Shigella)

Rappaport-buljong

Rappaport-buljong (modifierad enligt Vassiliadis och van Schothorst) utgör referensbuljong. Avsedd för anrikning av Salmonella-bakterier (utom S. Typhi och ett fĂ„tal andra stammar) frĂ„n bl.a. human feces. Selektiva egenskaper bygger framför allt pĂ„ Salmonella-bakteriernas bĂ€ttre förmĂ„ga att överleva hög magnesiumjonkoncentration Ă€n koliforma bakterier och deras relativa motstĂ„ndskraft mot malakitgrönt (0,4 %) i kombination med hög temperatur (41,5 °C + 0,5 °C). Rappaportbuljong förmĂ„r ofta anrika en insĂ„dd <10^2 (10^1) Salmonella-bakterier och samtidigt undertrycka >10^6 koliforma bakterier.

Recept: (Merck 1.07700.0500) Rapportbuljong

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Soyapepton---- 4,5
  • Natriumklorid---- 8,0
  • KH2PO4---- 0,6
  • K2HPO4---- 0,4
  • MgCl2.6 H2O---- 29,0
  • Malakitgrönt---- 0,036

pH 5,2 + 0,2

Alternativ-buljonger

Selenit-buljong (laktosbaserad) Àr acceptabel som alternativ till referensbuljongen. Avsedd för anrikning av Salmonella-bakterier inkl. S. Typhi, men vissa Shigella (framför allt Shigella sonnei) kan ocksÄ anrikas. Baseras pÄ selektiva egenskaper hos natriumbiselenit, vilket i olöst tillstÄnd möjligen har teratogena egenskaper. Lösningen Àr korrosiv och kan orsaka sÄr pÄ hud. Det mÄste dÀrför tillsÀttas som lösning vilken förvaras i giftskÄp. Proteus och Pseudomonas inhiberas inte. Inkuberas i 35 °C - 37 °C (eventuellt 41,5 °C + 0,5 °C vilket kan undertrycka kontaminerande gramnegativ flora effektivare) i upp till 18-22 tim. Vid lÀngre tider kan de selektiva egenskaperna förloras.

Recept: (Laktosbaserad selenit buljong, Oxoid CM395)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pepton---- 5,0
  • Laktos---- 4,0
  • Natriumfosfat---- 10,0

pH 7,1 + 0,2

Natriumbiselenit (L121) tillsÀttes i lösning 4 gram.


Förutom Rappaport- eller selenitbuljong, anvÀndes ibland ocksÄ den mindre vÀldefinierade Muller-Kauffmann tetrathionate-buljongen för anrikning av Salmonella-bakterier (utom S. Typhi). Denna utnyttjar selektiva egenskaper hos oxgalla och brilliantgrönt och inkuberas i 41,5 °C + 0,5 °C.



Yersinia substrat

Bilaga 1.1.5

CIN-agar (Yersinia Selective Agar Base enligt Schiemann)

Indikation: För primÀrisolering av Yersinia enterocolitica (och Y. pseudotuberculosis ) frÄn humana fecesprov.

Princip: Mediet Àr optimerat för vÀxt av Y. enterocolitica efter 18-24 timmars inkubation i 28 °C - 32 °C. MÄnga stammar av Y. pseudotuberculosis vÀxer inom tvÄ dygn. Tillsatsen av Cefsulodin, Irgasan och Novobiocin (CIN) och natriumdesoxycholat Àr tillrÀcklig för att hÀmma flertalet bakterier ur normalfloran. Substratets grundfÀrg Àr blekt rosa. Typiskt koloniutseende för Yersinia-bakterier baserar sig pÄ fermentation av mannitol. Det skall dock observeras att CIN-agar inte kan skilja patogena biotyper frÄn apatogena. Dessutom antar vissa andra gramnegativa bakterier som förmÄr att vÀxa pÄ CIN-agar ofta samma koloniutseende som Yersinia. Dit hör Citrobacter, Serratia, Enterobacter, Pseudomonas (oftast fÀrglösa kolonier) samt Aeromonas. CIN-agar har dÀrmed hög selektiv men lÄg differentierande kapacitet. För komplett primÀr Yersinia-diagnostik krÀvs dÀrför kompletterande biokemi inklusive eskulinhydrolystest.

VĂ€xtarakteristika: Typiskt koloniutseende för Y. enterocolitica och Y. pseudotuberculosis Ă€r smĂ„ centralt mörkröda, i periferin fĂ€rglösa kolonier (bullÂŽs eye). JĂ€mfört med icke inhibitoriskt kontrollsubstrat vĂ€xer de flesta stammarna med GI >50 %.

Recept: (CIN-agar enligt Shiemann, LabM Lab 120)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Special pepton---- 22,5
  • Mannitol---- 20,0
  • Natriumklorid---- 1,0
  • Magnesiumsulfat---- 0,01
  • Natriumpyruvat---- 2,0
  • Natriumdesoxycholat---- 0,5
  • Neutralrött---- 0,03
  • Kristallviolett---- 0,001
  • Agar No. 2---- 12,0

pH: 7,4+ 0.2

TvÄ ampuller antibiotika CIN supplement X120 tillsÀttes. Dessa innehÄller:

  • Cefsulodin---- 7,5 mg
  • Irgasan---- 2,0 mg
  • Novobiocin---- 1,25 mg



Bilaga 1.1.6

Yersinia selective agar (enligt Wauters)

Förutom ovanstÄende referenssubstrat för primÀrisolering av Yersinia-bakterier, saluförs ocksÄ Yersinia selective agar enligt Wauters. Mediet baseras pÄ inhibition av normalfloran genom desoxycholate, oxgalla och citrat, medan grampositiv flora inhiberas av brilliantgrönt. Trots detta Àr substratet mindre selektivt Àn CIN-agar. I likhet med detta Àr substratet i liten omfattning differentierande.


Recept (Yersinia selective agar enl. Wauters, Merck cat. No 1.11443.0500)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L* Köttextrakt 5,0
  • Köttpepton---- 5,0
  • JĂ€stextrakt---- 5,0
  • Laktos---- 10,0
  • Neutralrött---- 0,025
  • Oxgalla---- 8,5
  • Natriumcitrat---- 10,0
  • Natriumtiosulfat---- 8,5
  • JĂ€rncitrat---- 1,0
  • Natriumdesoxycholate---- 10,0
  • Kalciumklorid---- 1,0
  • Brilliantgrönt---- 0,0003
  • Agar---- 12,0

pH 7,4 ±0.2

Det lÄngt mindre selektiva MacConkey-agarmediet understödjer ocksÄ vÀxt av Yersinia-bakterier och kan vara ett alternativ för primÀrisolering av Y. pseudotuberculosis.


Peptonbaserade anrikningsbuljonger för Yersinia saluförs med olika tillsatser av selektiva komponenter. Exempel pÄ sÄdana Àr Wauters medium och Ossmers medium. Inkuberingen i dessa sker i ett till tvÄ dygn i 22 °C - 30 °C. AnvÀndandet av sÄdana buljonger ingÄr inte i referensmetodiken, och vÀrdet av förfarandet Àr oklart.



Bilaga 1.1.7

SSI-Enteric medium

Indikation: Substratet Àr avsett för isolering av Salmonella, Shigella, Yersinia och E. coli frÄn humana fecesprov. Substratets plats i den diagnostiska arsenalen Àr oklar eftersom erfarenhet i landet saknas. En mindre utvÀrdering vid VÀsterÄslaboratoriet (ej omfattande Yersinia) antyder att substratet i klinisk praxis erbjuder relativt god differentiering av olika kolonityper.

Princip: Substratet Àr ett komplext medium som utvecklats av Statens Seruminstitut, Danmark. Det utnyttjar en kombination av dodecylbenzolsulfat och desoxycholat för inhibition av grampositiva bakterier och svÀrmning av Proteus. Obetydlig inhibition av gramnegativa stavar. Goda differentierande egenskaper. SÄlunda framtrÀder laktospositiva kolonier rosafÀrgade, H2S-producerande centralt grÄ-svarta. Brunt fÀrgomslag uppstÄr i mediet runt deaminaspositiva kolonier (Proteus). Mediets grundfÀrg Àr blekt rosa.

VĂ€xtkarakteristika: Salmonella vĂ€xer inom ett dygn med GI relativt CLED pĂ„ ca 100 % med stora slĂ€ta kolonier med svart centrum och uppklarning i mediet. Liksom Hektoen-agar ger det mycket god vĂ€xt ocksĂ„ av S. Senftenberg. Shigella vĂ€xer inom ett dygn med stora rĂ„a, fĂ€rglösa till rosa/röda kolonier med ett GI liknande det för DC-agar. God vĂ€xt av Yersinia enterocolitica som framtrĂ€der med smĂ„ kolonier eventuellt med rött centrum. Proteus mirabilis, Citrobacter braakii och E. coli (CCUG 17 621 och 30 600) inhiberas obetydligt (GI 60-100 %). Enterococcus hirae vĂ€xer inte. Det Ă€r mycket viktigt med ett omsorgsfullt gjort tertialstryk nĂ€r fecesprovet applicerats, sĂ„ att fria kolonier erhĂ„lls.

Recept: SSI-Enteric medium (Statens Seruminstitut, Danmark). Tillverkaren anger inte mÀngden av de enskilda komponenterna.

  • Pancreatic digest of casein. JĂ€stextrakt. Tri-Na-citrat, CaCl2, MgCl2, L-tryptoÂŹfan, L-fenylalanin, jĂ€rncitrat, dodecylbenzolsulfat, glukos, laktos, puryvat, desoxycholat, Na-thiosulfat, neutralrött, glycerofosfat, agar.



Campylobacter substrat

Bilaga 1.1.8


Blodfri selektiv campylobacteragar (CCDA)

Indikation: PrimÀrisolering av Campylobacter jejuni/coli frÄn humana fecesprov.

Princip: I detta medium har blod ersatts av bakteriologiskt kol, jÀrnsulfat och natriumpyruvat, vilket ger mediet en svart grundfÀrg. En vÀl balanserad peptonblandning ger god vÀxt av flertalet typer av Campylobacter Àven vid 37 °C. Tillsats av selektivt supplement undertrycker normalfloran och vissa Campylobacter-arter, men tillÄter vÀxt av C. jejuni/coli och C. lari. Supplementet bestÄr av cefoperazone och amfotericin, vilket tillsammans med desoxycholat effektivt inhiberar de flesta bakterier och svampar ur normalfloran. Tillsats av kristallviolett kan ytterligare förstÀrka inhibition av grampositiva bakterier. För isolering av mer antibiotikakÀnsliga arter som exempelvis C. upsaliensis och C. fetus mÄste selektivt supplement utelÀmnas. Campylobacter vÀxer med typiskt koloniutseende och med ringa genomslag av kontaminerande fecesflora efter 18-24 (48) timmars inkubering i 37 °C - 42 °C i mikroaerofil miljö.

VĂ€xtkarakteristika: Campylobacter vĂ€xer vid rekommenderade 42 °C inom tvĂ„ dygn med GI relativt hĂ€stblodagar pĂ„ 20-90 %. Kolonierna Ă€r stora, platta och oregelbundet formade med en diameter pĂ„ 0,5 – 1 cm. Kolonierna Ă€r genomskinliga till semiopaka och kan delvis anta en grĂ„blĂ„ fĂ€rg. ”Metalliskt” inslag Ă€r vanligt. VĂ€xtsĂ€ttet Ă€r ofta utflytande eller ”svĂ€rmande”.

E coli, Proteus mirabilis, Citrobacter braakii, enterokocker och Pseudomonas inhiberas effektivt. Genomslag av ett par till flera kolonier av gramnegativ kontaminerande flora förekommer dock i ca 15 % av odlingar.


Recept: Blodfri selektiv campylobacteragar (CCDA enligt Hutchinson och Bolton, LAB M 112).

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Peptonblandning---- 25,0
  • Bakteriologiskt kol---- 4,0
  • NaCl---- 3,0
  • Natriumdesoxycholat---- 1,0
  • JĂ€rnsulfat---- 0,25
  • Natriumpyruvat---- 0,25
  • Agar No 2---- 12,0

PH 7,4 ± 0,2

Tillred blodfri selektiv campylobacteragar efter tillsats av kristallviolett 1 mL 0,1 % till 1000 mL och antibiotikasupplement X112 (cefoperazone 32 mg/L och amfotericin 10 mg/L). Supplementet X112 utelĂ€mnas vid tillredning av blodfri campylobacteragar utan antibiotika.



Bilaga 1.1.9

Campylobacteragar enligt Skirrow

Förutom ovanstĂ„ende referenssubstrat för primĂ€risolering av Campylobacter Ă€r en nĂ„got mindre selektiv blodbaserad campylobacteragar enligt Skirrow ett accepterat alternativ. Denna understödjer vĂ€xt av Campylobacter jejuni/coli marginellt bĂ€ttre Ă€n referenssubstratet, men med större genomslag av kontaminerande normalflora. Vid tillredningen rekommenderas blod-agarbas no 2 framför Brucella-agarbas (medger bĂ€ttre CampylobactervĂ€xt och inhibition av normalfloran). Mediets grundfĂ€rg Ă€r djupröd. Typiska kolonier av Campylobacter vĂ€xer inom tvĂ„ dygn med 0,5-1 cm stora oregelbundna, platta krĂ€mfĂ€rgade eller grĂ„a kolonier som sĂ€rskilt pĂ„ nytillverkat substrat tenderar att svĂ€rma. GI relativt hĂ€stblodagar Ă€r 50-100 %.

Recept: Blodbaserad campylobacteragar enligt Skirrow.

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Blod-agarbas no 2 (OXOID CM 271) (1)---- 40,0
  • Campylob selective suppl (OXOID SR 069E) (2) ---- 2 ampuller/1000 mL medium
  • Defibrinerat hĂ€stblod---- 50,0-70,0 mL

(1)

  • Proteos pepton---- 15,0 g
  • Leverextrakt---- 2,5 g
  • JĂ€stextrakt---- 5,0 g
  • NaCl---- 5,0 g
  • Agar---- 12,0 g

H 7,4 ± 0,2

(2)

En ampull (för 500 mL medium) innehÄller:

  • Vankomycin---- 5,0 mg
  • Trimetoprim---- 2,5 mg
  • Polymyxin B---- 1250 IU




Clostridium difficile substrat

Bilaga 1.1.10


CCFA- Cykloserin- Cefoxitin- Fruktos- Agar

Indikation: För primÀr isolering av Clostridium difficile frÄn humana fecesprov.

Princip: Selektivt substrat som understödjer vĂ€xt av de flesta stammar av C. difficile. Mediet har utan blodtillsats en ljust orange/aprikos grundfĂ€rg. Selektiva komponenter Ă€r D-cykloserin 250-500 ÎŒg/mL och cefoxitin 8-16 ÎŒg/mL. De högre koncentrationerna kan verka inhiberande pĂ„ vissa C. difficile-stammar. Selektiviteten kan dock minska betydligt vid anvĂ€ndandet av de lĂ€gre koncentrationerna. Vid denna nivĂ„ rekommenderas i litteraturen alkoholbehandling av provet före applikation. (De enskilda laboratorierna bestĂ€mmer utifrĂ„n detta lĂ€mplig koncentration). Med den högre koncentrationen inhiberas mĂ„nga av normalflorans Enterobacteriaceae, E. faecalis, stafylokocker, anaeroba bakterier (inkluderande mĂ„nga andra arter av klostridier). Fruktos som inkorporerats i mediet understödjer vĂ€xt av C. difficile. Idag rekommenderas tillsats av 7 % defibrinerat hĂ€stblod vilket enligt vissa författare signifikant ökar sensitivitet jĂ€mfört med ingen tillsats eller tillsats av Egg-yolk. Observera att olika fabrikat och sannolikt olika loter kan uppvisa stora skillnader. Noggrann lotjĂ€mförelse rekommenderas vid upphandling.

VĂ€xtkarakteristika:

Medium med blod (referensberedning): Clostridium difficile vĂ€xer inom tvĂ„ dygn med platta, grĂ„a kolonier ofta med utseende ”stekt Ă€gg” utan hemolys. Kolonierna kan ocksĂ„ vara utflytande och konfluerande. Storlek varierar uppĂ„t frĂ„n ca 4 mm diameter. Typisk ”stallukt”. Vid genomslag av koliforma kontaminanter (ofta kraftigare Ă€n med plattor utan blod) ses dessa som mindre (ett par mm diameter) grĂ„vita blanka kolonier.

Medium utan blod: Clostridium difficile vĂ€xer inom tvĂ„ dygn med platta, gula, runda eller oregelbundet formade kolonier, med gult omslag i mediet. RGI jĂ€mfört med CCFA med blod 10-50 % (jĂ€mförelse gjord pĂ„ VĂ€sterĂ„slaboratoriet). Storlek varierar mellan 2-5 mm diameter. Typisk ”stallukt”. SĂ€rskilt vid inkuberingstider överstigande tre dygn ofta genomslag av kontaminerande normalflora Ă€ven vid höga koncentrationer av inhibitorer. Kolonierna Ă€r dock ofta smĂ„ och rosa och lĂ€tta att skilja frĂ„n C. difficile.

Recept: CCFA (Referensfabrikat anges ej)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Proteos pepton---- 40,0
  • Fruktos---- 6,0
  • DiNatriumfosfat---- 5,0
  • Kaliumfosfat---- 1,0
  • Magnesiumsulfat---- 0,1
  • NaCl---- 2,0
  • Neutralrött (ej om blodtillsats)--- 0,03
  • Agar---- 15,0

pH 7,4 ± 0,2

Bered CCFA enligt tillverkarens anvisningar med tillsats av 7 % defibrinerat hĂ€stblod (och/eller Egg Yolk emulsion 2,5 ml/L), cykloserin (0,25-0,5 g/L) och cefoxitin (0,008-0,016 g/L).



EHEC

Bilaga 1.1.11

Sorbitol MacConkey-agar (SMAC)

Indikation: För primÀr isolering av E. coli O157:H7 frÄn humana fecesprov.

Princip: SMAC Àr i princip identisk med MacConkey-agar no 3 (se detta substrat) men dÀr laktos ersatts med samma mÀngd sorbitol. DÀrvid blir sorbitolpositiva bakterier rosa/röda medan negativa förblir ofÀrgade. DÄ de flesta stammar av E. coli Àr sÄvÀl laktos som sorbitolpositiva Àr ett antal stammar enbart laktospositiva. SÄdana sorbitolnegativa stammar Äterfinns bland rörliga isolat av serotyp O157 (E. coli O157:H7). Orörliga stammar (E. coli O157:H-) Àr laktospositiva.

Selektiv SMAC, CT-SMAC: För isolering av EHEC O 157 anvÀnds ibland SMAC med tillsats av cefixime 0,05 mg/L och kaliumtellurit 2,5 mg/L.

VĂ€xtkarakteristika: Kolonimorfologi och vĂ€xtsĂ€tt Ă€r i princip som för MacConkey-agar no 3. E. coli O157:H7 vĂ€xer med fĂ€rglösa men för övrigt typiska E. coli-kolonier. Det bör observeras att laktosnegativa bakteriearter kan vara sorbitolpositiva (rosa/röda) pĂ„ SMAC. Dit hör mĂ„nga stammar av Salmonella, Shigella (40 %) och Yersinia. Typiskt sorbitol-negativa gramnegativa bakteriearter Ă€r Hafnia, Morganella och Proteus.

Recept: SMAC (Oxoid CM813)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pepton---- 20,0
  • Sorbitol---- 10,0
  • Gallsalter no 3---- 1,5
  • NaCl---- 5,0
  • Neutralrött---- 0,03
  • Kristallviolett---- 0,001
  • Agar---- 15,0

pH 7,1 ±-0,2


Bilaga 1.1.12

Buffrat peptonvatten (BPV)

Indikation: För anrikning av EHEC

Princip: Enterobakterier vÀxer snabbare Àn mÄnga andra bakterier

Recept

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pepton Difco---- 10 g
  • NaCl---- 5 g
  • DinatriumvĂ€tefosfat x12 H2O---- 9 g
  • KaliumdivĂ€tefosfat---- 1,5 g
  • Ultrarent vatten---- 1000 ml

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C




Vibrio

Bilaga 1.1.13

Tiosulfat- citrat- galla- sackaros- agar (TCBS)

Indikation: För selektiv isolering av Vibrio frÄn humana fecesprov och sekundÀrisolering efter anrikning i alkaliskt peptonvatten.

Princip: TCBS utvecklades av Kobayaski et al. 1963 för isolering av Vibrio cholerae. Substratet undertrycker vÀxt av praktiskt taget alla bakteriearter i normal tarmflora under 24 timmar, medan de allra flesta stammar av humanpatogena Vibrio (ej V. hollisae) vÀxer ut. Viss vÀxt av Proteus och enterokocker kan dock förekomma under första dygnet, liksom av Aeromonas. Mediets selektiva egenskaper Ästadkoms av alkaliskt pH (8,6), natrium-citrat, natrium-tiosulfat, oxgalla och hög salthalt (NaCl 10,0 g/L). Sackarospositiva bakterier blir gul/bruna med gult fÀrgomslag i mediet. Sackarosnegativa bakterier framtrÀder blÄ till gröna. Trots identiska recept har vid substrattestning (West et al 1982) stora variationer pÄvisats mellan olika fabrikat och Àven avseende reproducerbarhet vid anvÀndandet av olika laboratoriestammar. Aktuell utvÀrdering saknas, varför referensfabrikat av TCBS ej kan anges.

VÀxtkarakteristika: Vibrio cholerae och V. fluvialis vÀxer inom 24 timmar vid 35 °C med platta jÀmna gul/bruna kolonier med en diameter av 2-3 mm. V. parahaemolyticus vÀxer med blÄ-gröna 2-5 mm stora platta kolonier. Eventuellt genomslag av fecesflora upptrÀder med mindre (1 mm diameter) gula eller blÄ/gröna kolonier.



Recept: TCBS-agar (Referensfabrikat anges ej)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • JĂ€stextrakt 5,0
  • Pepton 10,0
  • Natriumtiosulfat 10,0
  • Natriumcitrat 10,0
  • Oxgalla 8,0
  • Sackaros (Sukros) 20,0
  • NaCl 10,0
  • JĂ€rncitrat 1,0
  • BromtymolblĂ„tt 0,04
  • ThymolblĂ„tt 0,04
  • Agar 15,0

pH 8,6 ± 0,2



Bilaga 1.1.14

Alkaliskt peptonvatten

Indikation: Anrikning av kolerabakterier.

Princip: Vibrio cholerae vÀxer snabbare Àn alla andra bakterier, speciellt vid basiskt pH.

Recept

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pepton Acumedia---- 10 g
  • NaCl---- 5 g
  • RO-vatten---- 1000 mL
  • NaOH---- ca mL

ca mL pH 9,1± 0.1


Beredning: VÀg upp pepton och salt och blanda i vattnet i en flaska eller kolv. Justera pH med NaOH. Dispensera i glasrör med skruvlock ca 10 mL per rör. Autoklavera i 20 min i 120 °C.


Internkontroll: Satskontroll vid varje tillverkningsomgÄng. V. cholerae ATCC 14035 god vÀxt E. coli CCUG 17620 ingen vÀxt eller hÀmmad Inkubering aerobt i 35 °C 1 dygn

Förvaring och hÄllbarhet: 6 veckor i kyl. Om hÄllbarhetsdatum passerats kan rören anvÀndas efter kontroll av pH samt om kontrollstam sÀtts samtidigt som prov odlas.



Övriga fasta substrat

Bilaga 1.1.15

MacConkey-agar

Indikation: Rensspridning av misstÀnkta Salmonella-, Shigella- och Yersinia-bakterier i samband med initial identifiering enligt minimikriterier och som komplement vid primÀr isolering frÄn humanfeces av Y. pseudotuberculosis.

Princip: Olika typer av MacConkey-agar finns kommersiellt tillgÀngliga. Referenssubstrat i detta sammanhang Àr komponerat för inhibition av grampositiva kocker inklusive enterokocker, men endast för ringa eller ingen inhibition av koliforma bakterier (Proteus svÀrmar ej). Detta uppnÄs med anvÀndande av en kombination av olika gallsalter och kristallviolett. Mediet innehÄller laktos och neutralrött. Detta medför att laktospositiva bakterier blir rosa-röda, medan laktosnegativa bakterier förblir fÀrglösa.

VĂ€xtkarakteristika: Salmonella-bakterier vĂ€xer inom ett dygn med GI överstigande 80 % jĂ€mfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall (undantag t.ex. S. Senftenberg CCUG 37886). Kolonierna Ă€r dĂ€rvid konvexa, semiopaka, blanka, ibland rĂ„a och fĂ€rglösa. Kolonidiametern motsvarar den för DC-Hynes. Shigella-bakterier vĂ€xer inom ett dygn med GI överstigande 50 % med konvexa, semiopaka, rĂ„a och fĂ€rglösa kolonier. Yersinia (sĂ„vĂ€l Y. enterocolitica som Y. pseudotuberculosis) vĂ€xer inom ett dygn med smĂ„ eller mycket smĂ„ kolonier och ett GI jĂ€mfört med CLED-agar pĂ„ ca 25-50 %. Kolonierna Ă€r konvexa, semiopaka, slĂ€ta och fĂ€rglösa.

E. coli och andra laktospositiva koliforma bakterier vĂ€xer med GI överstigande 50 % med rosa/röda kolonier. Proteus-bakterier svĂ€rmar ej. Enterokocker vĂ€xer ej. Substratets egenskaper gör det lĂ€mpligt att anvĂ€nda vid renspridning av misstĂ€nkta Salmonella-, Shigella- och Yersinia-bakterier i samband med identifiering enligt minimikriterier. Mer selektiva substrat Ă€r i sammanhanget olĂ€mpliga, eftersom dessa kan undertrycka eventuella förorenande koliforma bakterier.


Recept: (MacConkey-agar no. 3, Oxoid CM 115)

  • InnehĂ„ll--- Gram/L
  • Pepton---- 20,0
  • Laktos---- 10,0
  • Gallsalter no.---- 3 1,5
  • NaCl---- 5,0
  • Neutralrött---- 0,03
  • Kristallviolett---- 0,001
  • Agar---- 15,0

pH: 7,1+0,2



Bilaga 1.1.16

Egg-Yolk-agar

Indikation: PÄvisande av lecitinasproduktion vid diagnostik av i första hand Bacillus cereus, Clostridium perfringens och andra klostridiearter associerade till klinisk gasbrand och matförgiftning. Differentiering av fusobakterier genom pÄvisande av lipas-aktivitet. Prevotella spp kan uppvisa bÄde lecitinas-och lipasaktivitet.

Princip: Äggula (Egg yolk) innehĂ„ller lecitin och fria fetter, substrat som Ă€r lĂ€mpade för pĂ„visande av mikrobiell produktion av lecitinas och lipaser. McClug, Toube och Hayward beskrev 1941 att Clostridium perfringens som vĂ€xer pĂ„ fast medium innehĂ„llande Ă€gguleemulsion orsakar ett kraftigt mjölkigt precipitat i mediet inom 24 timmar. Precipitatet uppstĂ„r genom att bakteriellt lecitinas (fosfolipas C, alfa-toxin som vid mjukdelsinfektioner spelar stor roll till uppkomst av klinisk gasbrand) spjĂ€lkar lecitin (fosfatidylkolin, vitellin) i sina bestĂ„ndsdelar fosforylkolin och diglycerider. De senare reagerar med i Ă€ggulan kvarvarande vitellin och vitellinin under precipitatbildning. Lecitinaser med samma effekt produceras ocksĂ„ av andra klostridiearter som C. novyi, C. bifermentans, C. limosum och C. sordelli. Andra bakterietyper som B. cereus, B. anthracis, S. aureus och vissa stammar av B. cepacia producerar ocksĂ„ pĂ„visbart lecitinas. För att sĂ€kerstĂ€lla att uppkommet precipitat hĂ€rrör frĂ„n bakteriellt lecitinas anvĂ€ndes tidigare neutraliserande artspecifikt antitoxin som applicerades pĂ„ halva agarytan med effekten att bakterierna vĂ€xte dĂ€r utan bildning av precipitat (Naglers reaktion). Numera appliceras ofta istĂ€llet positiv och negativ bakteriekontroll pĂ„ testplattan.

Mikroorganismer med lipas-aktivitet hydrolyserar fetter i mediet till glycerol och fria fettsyror. Olösliga fria fettsyror bildar inom tvÄ till fem dygns inkubering ett regnbÄgsskimrande oljigt lager ovanpÄ kolonierna som kan ses om plattan hÄlls i vinkel mot en ljuskÀlla. Metoden Àr anvÀndbar för att differentiera mellan fusobakterier, Fusobacterium necrophorum Àr dÀrvid positiv, övriga fusobakterier negativa. Lipasproduktion förekommer ocksÄ hos andra bakteriearter, exempelvis C. sporogenes

Vissa bakterier orsakar en begrÀnsad uppklarning av mediet i omedelbar anslutning till kolonierna orsakat av proteas-aktivitet.

VÀxtkarakteristika: Inom ett dygn vÀxer C. perfringens och B. cereus (aerob inkubering varvid B. subtilis utgör lÀmplig negativ kontroll) anlagda i raka stryk med frodigt grÄ-vitt, rÄtt, matt utseende. I mediet syns ett kraftigt frÄn ca 1,5 cm brett homogent opakt relativt vÀlavgrÀnsat precipitat talande för lecitinasproduktion. Observera att B. cereus till skillnad frÄn B. subtilis Àven kan inkuberas anaerobt. Fusobakterier vÀxer inom ett eller nÄgra dygn med fÀrglösa platta kolonier, varvid Fusobacterium necrophorum med ett regnbÄgsskimrande oljigt lager pÄ ytan synligt om plattan hÄlls i vinkel mot ljuskÀllan som tecken pÄ lipasaktivitet.


Recept: (Egg-yolk-agar)

Olika agarbaser (ofta specialkomponerade) har genom Ären anvÀnts tillsammans med egg-yolk-emulsion för att pÄvisa lectinasbildning hos framförallt B. cereus och klostridier associerade till gasbrand. I dag Àr det vanligt att vid diagnostik av renspridda isolat för denna reaktion anvÀnda kommersiell blodagarbas (till exempel Columbia-agar) kompletterad med 1% koksalt och egg-yolk-emulsion (recept nedan). Substratets grundfÀrg Àr dÀrvid blekt gulvit, semiopakt.


  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Columbia blod agar bas (1) 43
  • NaCl 10
  • Egg-Yolk-emulsion (Oxoid SR47) 100 mL


(1)

(Acumedia no 7125)

  • InnehĂ„ll---- Gram/L
  • Pankreasdigererat kasein---- 5,0
  • Köttextrakt---- 8,0
  • JĂ€stanrikad pepton---- 10,0
  • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
  • NaCl---- 5,0
  • Agar---- 14,0

pH 7,6 ± 0,1 (slut-pH)


Bered Egg-yolk agar efter tillsats av egg-yolk emulsion till avsvalnad (50 °C) blod-agarbas med extra NaCl.


Transportsubstrat

Bilaga 1.1.17

Olika typer av transportsubstrat avsedda för alla typer av kliniskt bakteriologiska prover finns idag tillgÀngliga. Dessa baseras huvudsakligen pÄ Stuarts medium frÄn 1940-talet, vilket senare modifierats för bÀttre överlevnad bland annat av gonokocker, men ocksÄ för att bÀttre bibehÄlla balansen mellan olika bakteriearter nÀr provet innehÄller blandflora. I dag anvÀnds oftast Amies kolade transportmedium. Kolillsatsen (Charcoal) neutraliserar toxiska fettsyror, varvid man slipper anvÀnda kolade bomullspinnar vid provtagningen. Stuarts medium innehÄller glycerofosfat, vilket kan metaboliseras av vissa koliforma bakterier med risk för tillvÀxt under transporten. DÀrför har i Amies medium detta bytts ut mot oorganiskt fosfat. Amies transportmedium Àr inte optimerat för transport av fecesprover innehÄllande Shigella och Campylobacter, men dessa överlever minst 24 timmar i mediet vid kylförvaring. Ett speciellt transportmedium för fecesprover Àr Cary-Blair-medium. Detta Àr buffrat till pH 8,4, vilket förlÀnger överlevnad av Shigella och Vibrio cholerae till Ätskilliga dygn. Cary-Blair-medium Àr inte avsett för transport av andra typer av bakteriologiska prover.

Trots att Cary-Blair-medium har bÀttre egenskaper vid lÀngre tids förvaring (>48 timmar) anger vi det mer generella och mycket anvÀnda Amies medium som referenssubstrat. Det Àr dock viktigt att vara uppmÀrksam pÄ nödvÀndigheten av korta transporttider för Shigella (sÀrskilt Shigella flexneri), Campylobacter och Vibrio.

Recept: Amies transportmedium med charcoal (Copan, Venturi Transystem).

  • InnehĂ„ll Gram/L
  • Charcoal 10,0
  • NaCl 3,0
  • NatriumvĂ€tefosfat 1,15
  • KaliumdivĂ€tefosfat 0,2
  • KCl 0,2
  • Natriumtioglykollat 1,0
  • CaCl2 0,1
  • MgCl2 0,1
  • Agar 4,0

PH 7,2 ± 0,2

Transportrör finns kommersiellt tillgÀngliga. I certifierad batchprövning ingÄr bland annat Shigella och Campylobacter med angiven överlevnad minst 24 timmar.

REFERENSER

Se Bilaga 1b. Substratkontroll