Bilaga 1b. Substratkontroll

Hoppa till: navigering, sök

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002


Bilaga 1.b

Substratkontroll

Ett stort antal olika odlingsmedia för primär isolering av tarmpatogener finns kommersiellt tillgängliga. Dessa är regelmässigt noggrant kvali­tetskontrollerade av producenten, vilka på begäran bifogar analys­certi­fikat över aktuell lot. Detta innehåller uppgifter bl.a. om komposition, fysikaliska egenskaper, od­lingsegen­skaper med olika referensstammar, förvaring etc. enligt tillgängliga standarder, exempelvis NCCLS Doc M22-A. Trots detta föreligger skillnader mellan olika fabrikat av samma medium. Dessa skillnader kan avseende såväl selektiva som dif­ferentierande egenskaper uppnå statistisk signifikans, och därvid spela roll för diagnostiken. Vidare förekommer även vissa variationer mellan tillverknings­loter (batcher) av samma fabrikat, de senare sannolikt större ju mindre väldefi­nierat sub­stratet är. Detta innebär att tillgängliga kommersiella halvfabrikat kan variera avseende diagnostisk för­måga, beroende på skillnader i såväl selektiva som differentierande egenska­per. Vid det enskilda labo­ratoriet är sedan varia­tioner vid den fort­löpande tillverkningen inom en och samma lot oundvikliga.

Testförfarande inför upphandling av fasta substrat, referensmetod

Inför upphandling av selektiva fecessubstrat (beskrivningen avser i första hand DC-Hynes, XLD, Hektoen och CIN-agarmedier) skall jäm­förelse göras mellan pågående lot och prov från nya loter från en eller flera leverantörer. Loterna jämförs med avseende på selektiv och diffe­rentierande förmåga. En av loterna väljs därefter.

Den selektiva förmågan bedöms genom att studera växt av målbakte­rier och inhibition av normalflorans bakterier i jämförelse med växt på icke inhiberande kontrollsubstrat (uttrycks för vardera bakterieart som relative growth index, se definition nedan). Lämpligt koloniantal för målbakterier är ca 10^2, vilket mot­svarar ett bakterietal som är vanligt i den diagnostiska situationen (motsvarar ca 10^4-10^5 bakterier/g fe­ces). Koloniantalet är också lämpligt för att minimera de statistiska följderna av tekniska variationer. Den differentierande förmågan studeras ge­nom att bedöma parametrarna kolonidiameter, allmänt kolo­ni­ut­seende (opak, semiopak eller genomskinlig, slät eller rå, konvex eller platt, blank eller matt) och ko­lonifärg (färglös, d.v.s. lika substratet, rosa/röd, gul/vit, svart, grått eller rött kolonicentrum och ev. omslag i mediet samt andra ev. no­tabla karakteristika).

Betr√§ffande val av stammar f√∂r testningen √§r minimikravet att ur referens¬≠stams¬≠panelerna (se under re¬≠spektive patogen f√∂r m√•lbakterier och nedan f√∂r kontami¬≠nantstammar f√∂r val och f√∂rv√§ntat resultat) testa minst tv√• Salmonella-, Shigella- och Yersinia-stammar samt E. coli CCUG 17 620 och E. coli CCUG 30 600 (g√§ller XLD, Hektoen och DC-Hynes) eller tv√• Yersinia-stammar, E. coli enlig ovan och Citro¬≠bacter braakii CCUG 41766 (g√§ller CIN-agar). Principen √§r att utmana substraten med renkulturer av ‚ÄĚnormala‚ÄĚ stamtyper men ocks√• s√•dana m√•lbakterier som v√§xer d√•ligt och s√•dana kontaminanter som ofta f√∂r¬≠m√•r v√§xa p√• selektiva substrat.

Utförande:

  • 1. Slamma kolonier av utv√§xta bakterier fr√•n en agaryta (t.ex. blod) i 5 mL peptonbuljong med 1 % h√§stserum. Inkubera √∂vernatt i 35 ¬įC-37 ¬įC.
  • 2. Tv√§tta lagfaskulturerna x2 i PBS.
  • 3. Sp√§d bakteriekulturer i PBS till Mc Farland Standard 1 och sedan ned till motsvarande ca 10^2 CFU/50 ¬ĶL. Kontaminantkulturer sp√§ds ned till motsvarande ca 2x10^3 CFU/50 ¬ĶL f√∂r att uppn√• h√∂gre bakterietal p√• kontrollagarplattorna. Observera dock att vissa kontaminanter kr√§ver samma sp√§dning som m√•lbakteriena.
  • 4. Inokulera plattorna (testagar och kontrollagarplattor, som kontrol¬≠lagar anv√§nds CLED eller MacConkey) med vardera 50 ¬ĶL i duplikat (eller triplikat) och sprid j√§mt √∂ver agarytan med rackla eller sterila glaskulor.
  • 5. Inkubera √∂vernatt i 35 ¬įC - 37 ¬įC (CIN-agar i 28 ¬įC - 30 ¬įC).
  • 6. R√§kna antalet kolonier. Vid ingen eller mycket svag v√§xt inkube¬≠ras plattorna ytterligare ett dygn (g√§ller i f√∂rsta hand DC-Hynes). Koloniantalet b√∂r vara ca 10^2 f√∂r m√•lbakterierna. F√∂r kontami¬≠nantstammar skall bakterietalet i fall av kraftig inhibition ligga p√• ca 1,5-2x10^3 p√• kontrollagar¬≠plattan.
  • 7. Ber√§kna relative Growth index* (RGI) (se definition nedan).
  • 8. Bed√∂m och notera kolonidiameter, koloniutseende och kolonif√§rg samt eventuella andra karakte¬≠ristika.
    • Relative Growth index= CFU av enskild bakterietyp p√• test¬≠plattan/CFU av samma bakterietyp p√• icke in¬≠hiberande kontrollplatta. Kvoten uttrycks i procent. Detta b√∂r ligga √∂ver 50 % f√∂r m√•lbakterier med god v√§xt, men kan f√∂r m√•lbakte¬≠rier med d√•lig v√§xt ligga p√• ett par procent. Vissa kontaminantstammar v√§xer inte alls p√• testagar, detta in¬≠neb√§r ett RGI<0,1 %, men andra stammar inhiberas i mindre omfattning (se tabell 26).


Det är fördelaktigt (hör ej till referensmetodiken) att också inokulera bland­kulturer av referensstam­marna bestående av en (eller ett par) typer av mål­bakterier i kombination med två eller helst tre olika kon­taminanter. Man kan därvid jämföra substratens egenskaper i en situa­tion som i någon mån simule­rar ett kliniskt prov. Avsikten är i första hand att bedöma substratens differentie­rande egenskaper, d.v.s. koloni­karakteristika skall vara framträdande och en­skilda arter identifierbara. Det skall observeras att growth index för en viss bak­terieart som be­stämts för renkultur kan ändras när samma bakterieart in­okuleras till­sammans med andra bakteriearter. Förfarandet har ej standardiserats, men reproducerbara resultat kan nås med flera kombinationer (Thore, Lindman SMI-tryck 127-1999. ej i Wikiformat).

Testförfarande vid den fortlöpande tillverkningen av fasta substrat, refe­rensmetod

F√∂r fortl√∂pande tillverkningskontroll av selektiva substrat (i f√∂rsta hand DC-Hynes, XLD, Hektoen och CIN-agarmedier) utg√∂r Mossel¬īs eco¬≠metriska me¬≠tod referensmetod. Denna metod √§r enkel att ut¬≠f√∂ra och ger uppfattning om selektiv kapacitet hos substratet. Principen √§r att inokulera bakterier i log¬≠fas enligt ett visst m√∂nster p√• agarytan (Figur 16) och med hj√§lp av v√§xt-endpoint ber√§kna absolut growth index (AGI, f√∂r definition se Tabell 25) och relative growth index (RGI, f√∂r definition se nedan) efter j√§mf√∂relse mot v√§xt p√• kon¬≠trollagar. Det √§r tillr√§ckligt att testa en referensstam vardera av Salmonella, Shigella och Yersinia samt E. coli CCUG 17620.

Utförande:

  • 1. Respektive bakteriekulturer inokuleras i 5 mL peptonbuljong.
  • 2. Inkubera i 4 timmar i 35 ¬įC - 37 ¬įC.
  • 3. Indela agarplattan som skall testas i fyra segment m√§rkta A-D enligt fig 16.
  • 4. Doppa en 1 ¬ĶL plastin√∂s i buljongen d√§r bakterierna nu befinner sig i logfas. OBS! Endast sj√§lva √∂glan skall doppas, annars blir inoku¬≠latet f√∂r stort.
  • 5. Inokulera agarplattan med plastin√∂sen i konstant vinkel (ca 45¬į) en¬≠ligt fig 16. (fr√•n A1 till D5).
  • 6. Inokulera ytterligare en testplatta enligt moment 3-5 samt en kontroll¬≠platta (CLED-agar eller MacConkey-agar), f√∂r varje enskild bakterietyp.
  • 7. Inkubera plattorna √∂vernatt i 35 ¬įC - 37 ¬įC (CIN-agar i 28 ¬įC - 30 ¬įC).
  • 8. Notera det segment d√§r v√§xt sist f√∂rekommer (endpoint) p√• respek¬≠tive test- och kontrollplattor. Vid avsaknad av v√§xt i mer √§n tv√• seg¬≠ment (d.v.s. tv√• √∂verhoppade segment) anses endpointen vara den sista med v√§xt f√∂re avbrottet.
  • 9. Absolut growth index (AGI) kalkyleras enligt nedanst√•ende tabell 25 och relativ growth index (RGI) enligt formel (se under Tabell 25 nedan).


Krav för godkänd testning är växt på CLED-agar med ett AGI>75.


Mossel3.jpg


Notera det segment på respektive test- och kontrollplattor där växt sist före­kommer (endpoint). Vid avsaknad av växt i två segment eller fler (d.v.s. två eller fler överhoppade segment), sker avläsning i det närmast föregående seg­mentet med växt.


Tabell 25. Kalkylering av absolut growth index (AGI) genom ut­tryckande av ett indexvärde (5-100) från noterad växt-endpoint (A1-D5):

Kvadrant A Kvadrant B Kvadrant C Kvadrant D
A1 = 5 B1 = 10 C1 = 15 D1 = 20
A2 = 25 B2 = 30 C2 = 35 D2 = 40
A3 = 45 B3 = 50 C3 = 55 D3 = 60
A4 = 65 B4 = 70 C4 = 75 D4 = 80
A5 = 85 B5 = 90 C5 = 95 D5 = 1000

Formel för beräkning av relativ growth index (RGI):

  • AGI of test x 100
  • AGI of control


I Tabell 26 visas kontaminantstammar som kan användas vid kon­troll av fecessubstrat. Målbakteriestammar för substratkontroller redo­visas i Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial


Tabell 26. Kontaminantstammar att använda som referensstammar vid lottest­ning och fortlöpande tillverknings­kontroll av fecessubstrat enligt referens­metodiken.

Bakterie CCUG ATCC Karakteristika Växt på XLD^1 Växt på DC-Hynes^1 Växt på CIN^1
E. coli 17 620 25 922 negativ kontroll <0,1 <0,1 <0,1
E. coli 30 600 35 218 ej fullständig inhibition >25 <1 <0,1
Citrobacter braakii 41 766 >50 >25 >75
Proteus mirabilis 26 767 24 906 får ej svärma >50 >10 <0,1
P. aeruginosa 551 10 145 >25 >10 <0,1
Enterococcus hirae 1332 8043 negativ kontroll <0,1 <0,1 <0,1

^1 Avser relative growth index (uttryckt i procent) med pipetteringsteknik, d.v.s. antal CFU testagar x100/antal CFU kontrollagar (CLED eller Mac­Conkey)

Kommentar till referensmetodiken för testning av fasta substrat

Referensmetodiken anger nivå för substratkontroll med syftet att bi­behålla en hög och jämn kvalitet på de substrat som används vid feces­diagnostiken. Lot­jämförelse vid årlig upphandling skall utföras och dokumenteras. Om flera laboratorier går samman för gemensamt upp­köp av ett substrat, är det tillräck­ligt att ett av laboratorierna utför denna lotjämförelse. Fortlöpande tillverknings­kontroll på det enskilda laboratoriet skall utföras och dokumenteras. Ett accep­tabelt alternativ till Mossells ecometriska metod är att rensprida renkulturer upp­slammade i PBS av ett antal målbakterier och kontaminanter. En metod som också är användbar för MacConkey-agar. Härvid skall differentie­rande koloni­parametrar jämföras mot pågående serier varför det är vik­tigt att fria kolonier erhålles. Observera att ingen eller ringa uppfattning därvid erhålles om substra­tets selektiva egenskaper.

Testförfarandet vid den fortlöpande tillverkningen av anrikningsbuljonger (Rappaport och Selenit)

Vid den fortlöpande tillverkningen (kan också gälla lottestning inför uppköp) av anrikningsbuljonger för Salmonella-bakterier rekommende­ras nedanstående metoder avsedda att testa och dokumentera sub­stra­tens selektiva egenskaper och förmåga att anrika Salmonella. Observera att metoderna ej standardi­serats i tillräcklig omfattning och därför inte utgör referensmetodik. Principen är att utmana substratets egenskaper med metodologi som liknar den kliniska situatio­nen. Därvid kan de in­hibitoriska egenska­perna prövas genom att tillsätta ca 10^6 E. coli-bakterier (lämplig stam CCUG 30600) med krav på nära nog fullständig in­hibition, samtidigt som den anrikande förmågan prövas genom att till­sätta ca 10 S. Typhimurium (lämplig stam CCUG 31969) eller ca 10^2 S. Senftenberg (CCUG 37886) med krav på anrikning. Alter­nativt kan ne­gativ feces på bo­mullspinne (ca 0,02 g) tillsättas tillsammans med re­spektive Salmonella-stam­mar.

Utförande:

  • 1. Mixa omsorgsfullt i 5 mL PBS kolonier av E. coli fr√•n en agaryta (t.ex. blod) eller fr√•n en tv√§ttad √∂vernattkultur i buljong till McFarland 1,0 (motsvarar ca >5x10^7 bakterier/mL).
  • 2. Tills√§tt till √∂nskat antal r√∂r av testbuljongen vardera 30 ¬ĶL (pipett eller 3x10 ¬ĶL √∂gla) av E. coli-suspensionen (motsvarar drygt 106 bakterier).
  • 3. F√∂rfar p√• samma s√§tt med Salmonella-stammarna men sp√§d dessa till McFarland 0,5 och d√§refter ytterligare till l√§mplig koncentra¬≠tion (cirka 1,5x10^3 bakterier/mL av S. Typhimurium och 1,5x10^4 bakt/mL av S. Senftenberg).
  • 4. Tills√§tt 10 ¬ĶL (pipett eller 10 ¬ĶL √∂gla) av vardera Salmonella-suspension till de r√∂r d√§r E. coli inokulerats.
  • 5. Observera att det √§r l√§mpligt att fr√•n varje suspension g√∂ra viable count i detta skede.
  • 6. Inkubera r√∂ren √∂vernatt i angiven temperatur.
  • 7. Sprid med 1 ¬ĶL √∂gla p√• XLD (Hektoen), MacConkey och CLED.

F√∂rv√§ntat resultat: Salmonella anrikas och ger d√§rvid riklig utv√§xt p√• XLD (Hektoen); s√§krast resultat med Rappaport vid 41,5 ¬įC ¬Ī 0,5 ¬įC inkuberings¬≠tem¬≠pe¬≠ratur. Enstaka v√§xt av E. coli kan f√∂rekomma. MacConkey- och CLED-plattor anv√§nds som st√∂djande kontrollplattor, och f√∂rv√§ntas ge mer uttalad v√§xt av E. coli.

REFERENSER

  • Taylor, W.I. Isolation of Shigellae. Xylose, Lysine Agars; New media for the isolation of enteric pathogens. Am J Clin Path 1965;44:471-475.
  • Hynes. M. The isolation of intestinal pathogens by selective media. J Path Bact 1942;54:193-207.
  • King, S. and Metzger, W.I. A new plating medium for the isolation of enteric pathogens. Hektoen enteric agar. Appl. Microbiol 198;16:577.
  • Leifson, E. New Selenite enrichment media for isolation of typhoid and paraty¬≠phoid (Salmonella) bacilli. Am J Hyg 1936;24:423-432.
  • Peterz, M et al. The effect of incubation temperature and magnesium chloride concentra¬≠tion on growth of Salmonella in home-made and in commercially available dehydrated Rappa¬≠port-Vassiliadis broths. J Appl Bacterio¬≠l¬≠ogy.1989;66:523-528.
  • Vassiliades P. The Rappaport Vassiliades (R.V.) enrichment medium for the isolation of Salmonella: An overview. J Appl Bacteriol 1983;56:69-76.
  • Schiemann, D.A. Synthesis of a Selective agar medium for Yersinia enterocoli¬≠tica, Can J Microbiol 1979;25:1298-1304.
  • Blom et al. Evaluation of Statens Serum Institut Enteric Medium for detection of enteric pathogens. J Clin Microbiol. 1999;37:2312-2316.
  • Marler et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J Clin Microbiol. 1992;30:514-516.
  • George WL, Sutter VL, Citron D, Finegold SM. Selective and differential me¬≠dium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 1979;9:214,
  • MacConkey, A.T. Lactose ‚Äď fermenting bacteria in faeces J Hyg (Camb), 1905;5:333-379.
  • West et al. Statistical evaluation of a quality control method for isola¬≠tion of pathogenic Vibrio species on selected TCBS agars. J Clin Microbiol. 1982;16:1110-1116.
  • The Oxoid Manual 7th edition 1995 sid 2-171
  • G√§strin B, Kallings L O and Marcetic A. The survival time for different bacteria in various transport media. Acta Path Microbiol Scand 1968;74:371-380.
  • Wang, W-L, et al. Evaluation of transportmedia for Campylobacter jejuni in human fecal specimens. J Clin Microbiol 1983;18:803-807.
  • CEN pr EN TC 140/WG7/N22E. Culture media for microbiology-performance criteria for culture media.
  • Hyde, W.A. Quality control in medical bacteriology, a practical approach. Chapter 10. eds Hawkey and Lewis, 1989.
  • Miller, J.M. Quality control of Media, reagents and stains. Chapter 20. In Ma¬≠nual of Clinical Microbiology, 4th edition, 1990.
  • Mossel et al. Quality assurance of selective culture media for bacteria. J Appl Bacteriology. 1983;54:313-327.
  • NCCLS Document M22-A. Vol 10. No 14. 1990. Quality assurance for com¬≠mercially prepared microbiological culture media.
  • Rautio N. Performance criteria for culture media. Examensarbete 10p. Avd klin mikrobiol, UAS, 1995.
  • M Thore, R Lindman. Utv√§rdering av mikrobiologiska substrat f√∂r faecesdiag¬≠nostik och metoder f√∂r kontroll av s√•dana substrat. SMI-tryck nr 127-1999.
  • Weenk. Microbiological assessment of culture media: comparison and statistical evaluation of methods. Int J Food Microbiol 1992;17:159-81.