Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002


EJ REDIGERAD

PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (FolkhÀlsomyndigheten)

Analysprincip/teststrategi

Prov utodlas pÄ medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utvÀxta bakterierna i primÀrstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

Tabell 31.

  • MĂ„lgen Bakterietyp Amplimer
  • stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
  • stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
  • eae EHEC/EPEC 376 (bp)
  • ial EIEC/Shigella 320 (bp)
  • bfpA EPEC 367 (bp)
  • eltB ETEC 322 (bp)
  • estA ETEC 147 (bp)


Reagens

Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en tÀthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA frÄn de tvÄ EHEC stammarna blandas i förhÄllandet 1+1.

Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/”L, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.

dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.


Fecestabell32.jpg

Analysprocedur

  • Slamma bakterievĂ€xten frĂ„n primĂ€rstryket pĂ„ en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en tĂ€thet motsvarande MacFarland 4 (cirka 10^9-5x10^9 bakterier/mL).
  • Om bara ett fĂ„tal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40”L PBS.
  • Koka röret i 20 minuter.
  • Reaktionsrör med 40”L bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100 °C.
  • Pelletera cellresterna.

PCR

  • Mix / PCR-rör antal ”L
    • GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
    • dNTP 1,25mmol/L 1,6
    • MgCl2 25mmol/L 1,2
    • Primer av varje 2,5”mol/L 0,4
    • Taq 5U/”L 0,1
    • sterilt H2O upp till 18,0 ”L


TillsÀtt 2”L templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.


  • PCR-program
    • 4 min 96°C
    • 20 sek 94°C
    • 20 sek 55°C 30 cykler
    • 10 sek 72°C

7 min 72°C


Post-PCR

10 ”L av reaktionsvolymen frĂ„n varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 minuter. Om stx1 eller estA (130bp resp.147bp) Ă€r svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen pĂ„visar nĂ€rvaro eller frĂ„nvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

REFERENSER

  • MĂ„lgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
  • stx1 X07865
  • stx2 X07865
  • eae X60439
  • bfpA Z12295
  • eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
  • estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
  • ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256