Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC
Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002
EJ REDIGERAD
InnehÄll
PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (FolkhÀlsomyndigheten)
Analysprincip/teststrategi
Prov utodlas pÄ medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utvÀxta bakterierna i primÀrstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.
Tabell 31.
- MÄlgen Bakterietyp Amplimer
- stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
- stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
- eae EHEC/EPEC 376 (bp)
- ial EIEC/Shigella 320 (bp)
- bfpA EPEC 367 (bp)
- eltB ETEC 322 (bp)
- estA ETEC 147 (bp)
Reagens
Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en tÀthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA frÄn de tvÄ EHEC stammarna blandas i förhÄllandet 1+1.
Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.
AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/”L, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.
dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.
Analysprocedur
- Slamma bakterievÀxten frÄn primÀrstryket pÄ en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en tÀthet motsvarande MacFarland 4 (cirka
-5x
bakterier/mL).
- Om bara ett fÄtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40”L PBS.
- Koka röret i 20 minuter.
- Reaktionsrör med 40”L bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100 °C.
- Pelletera cellresterna.
PCR
- Mix / PCR-rör antal ”L
- GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
- dNTP 1,25mmol/L 1,6
- MgCl2 25mmol/L 1,2
- Primer av varje 2,5”mol/L 0,4
- Taq 5U/”L 0,1
- sterilt H2O upp till 18,0 ”L
TillsÀtt 2”L templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.
- PCR-program
- 4 min 96°C
- 20 sek 94°C
- 20 sek 55°C 30 cykler
- 10 sek 72°C
7 min 72°C
Post-PCR
10 ”L av reaktionsvolymen frÄn varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 minuter. Om stx1 eller estA (130bp resp.147bp) Àr svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen pÄvisar nÀrvaro eller frÄnvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.
REFERENSER
- MÄlgen à tkomstnummer EMBL DNA-databas
- stx1 X07865
- stx2 X07865
- eae X60439
- bfpA Z12295
- eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
- estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
- ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256