Bilaga 4. Virologiska metoder

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002


VIROLOGISKA METODER

Bilaga 4.1

BestÀmning av rotavirusantigen i feces med ELISA

ELISA-plattor: Costar EIA/RIA nummer 3590

TvÀttbuffert: 0.9% NaCl + 0.05% Tween 20

Antikropp för coatning: Marsvin-antihuman rotavirus-serum (FolkhÀlsomyndigheten)

Coatningsbuffert: 0.05M sodiumcarbonate, pH 9.5-9.7

Provmaterial: 10% feces-suspension i PBS

SpÀdningsbuffert: Trypsineringsbuffert med 0.5% BSA

Antikropp för detektion: Kanin-anti-human rotavirus (FolkhÀlsomyndigheten)

Konjugat: PeroxidasmÀrkt get-antikanin IgG (Bio-Rad)

Substratbuffert: 0,1M Na-citrat-Hac-buffert pH 6.0 innehÄllande 0,002% H2O2

Substrat: Tetrametyhylbenzidin, TMB (ICN). TMB.stock; lösning 1% 3.3Ž,5.5Ž tetramethylbenzidin upplöst i DMSO.

  • Metod:
    • 1. Coata med 100 ÎŒL/brunn av marsvin-antihuman rotavirus-serum spĂ€tt 1/500 i coatningsbuffert. Inkubera över natt vid +4 °C eller 3 timmar vid +37 °C.
    • 2. TvĂ€tta 4 gĂ„nger med tvĂ€ttbuffert.
    • 3. SpĂ€d feces 1/10 i PBS – 0.05% BSA. TillsĂ€tt i duplikat 100 ÎŒL/brunn. Inkubera 120 min vid 37 °C.
    • 4. TvĂ€tta 4 gĂ„nger med tvĂ€ttbuffert.
    • 5. TillsĂ€tt 100 ÎŒL/brunn av kanin-anti-human rotavirus spĂ€tt 1/1000 i spĂ€dningsbuffert. Inkubera i 90 min vid 37 °C.
    • 6. TvĂ€tta 4 gĂ„nger med tvĂ€ttbuffert.
    • 7. TillsĂ€tt 100 ÎŒL/brunn av peroxidasmĂ€rkt get-anti-kanin IgG spĂ€tt 1/50 000 i spĂ€dningsbuffert. Inkubera i 60 min vid +37 °C.
    • 8. TvĂ€tta 6 gĂ„nger med tvĂ€ttbuffert.
    • 9. Blanda substratlösningen strax innan anvĂ€ndning: 100 ÎŒL TMB stocklösning i 10 mL substratbuffert. TillsĂ€tt 100 ÎŒL/brunn Ă€ven dör blankavlĂ€sning skall göras. Inkubera plattan i 5-10 min vid rumstemperatur.
    • 10. Reaktionen stoppas genom tillsats av 100 ÎŒL 2M H2SO4/brunn Ă€ven dĂ€r blankavlĂ€sning skall göras.
    • 11. AvlĂ€s vid 450 nm i en ELISA-spektrofotometer.


Bilaga 4.3

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

Faecesprovet blandas med vĂ€tska i transportröret/provtagningsröret (virus transportmedium, PBS eller fysiologiskt koksalt) till en 10-20 % suspension och homogeniseras med vortex, gĂ€rna med tillsats av glaskulor. Provet överförs sedan till ett eppendorfrör och centrifugeras i 5 min. Hastigheten avgörs av provets sammansĂ€ttning och man bör erhĂ„lla en överfas som gĂ„r att pipettera. 200 ”l av denna övervĂ€tska anvĂ€nds sedan direkt för extraktion av adenovirus-DNA med hjĂ€lp av QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN) enligt medföljande Blood &Body Fluid Spin Protocol.

Arbetet bör ske i sterilbÀnk (skyddsklass 2) och speciella locköppnare kan anvÀndas till eppendorfrören under extraktionen för att minimera risk för kontamination. Prov som innhÄller de enteriska varianterna av adenovirus samt prov frÄn immunosupprimerade patienter kan innehÄlla mycket stora kvantiteter av virus och kontaminationsrisken kan i dessa fall betecknas som stor.

PCR-reaktionen sker i en totalvolym pÄ 50 ”l innehÄllande 10 ”l QIAgen-extra-herat prov i 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,0 (20 °C), 200 ”M av varje dNTP, 0,5 ”M av vardera yttre primer eller 0,5 ”M av vardera inre primer samt 1 U Taq DNA polymerase.

  • PCR-program första amplifieringssteget:
    • 1. 95 °C 3 min 1 cykel
    • 2. [94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 1min] 30cykler
    • 3. 72 °C 3 min 1 cykel

5 ”l av amplifieringsprodukt frÄn det första PCR-steget överförs till en ny identisk PCR-mix pÄ 45 ”l för nested PCR, dock nu med inre primers. Denna mix blandas pÄ speciellt avgrÀnsad yta endast avsedd för hantering av redan amplifierat material. OBS! PCR-röret frÄn det första amplifieringssteget skall centrifugeras för att avlÀgsna kondens innan det öppnas för överföring av amplifikat. Detta Àr mycket viktigt för att undvika eventuell kontaminering.

  • PCR-program andra amplifieringssteget; nested PCR:
  • 1. 94 °C 1 min 1 cykel
  • 2. [94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 1min] 30 cykler
  • 3. 72 °C 3 min 1 cykel


Efter avslutad amplifiering analyseras 15 ”l amplifieringsprodukt frĂ„n bĂ„de första och andra (nested) amplifieringsstegen tillsammans med 0,5 ”g av en definierad molekylviktsstandard pĂ„ en 2,0-2,5 % agarosegel av kvalitet med hög upplösning för gel-elektrofores. Varje prov och standarden blandas med 2,0 ”l loadingbuffert innan separation pĂ„ gel. Vid en spĂ€nning pĂ„ 100V +- 30V berĂ€knas en migrationstid pĂ„ 3 +- 1,5 tim för tillfredstĂ€llande utvĂ€rdering av slutprodukt. Efter slutförd elektrofores infĂ€rgas agarosgelen med etidiumbromid (2 ”g/ml) i 15 min +- 10 min. (PCR-produkter = 301bp respektive 171bp för enkel och nested PCR).

  • Primersekvenser:
    • Hex1deg 5ÂŽ-GCC (CG)CA (GA)TG G(GT)C (TA)TA CAT GCA CAT C-3ÂŽ
    • Hex2deg 5ÂŽ-CAG CAC (GC)CC ICG (AG)AT GTC AAA-3ÂŽ

OvanstÄende primers kombineras med följande primerpar i nested PCR.

  • nestHex3deg 5ÂŽ-GCC CG(CT) GC(AC) ACI GAI AC(GC) TAC TTC-3ÂŽ
  • nestHex4deg 5ÂŽ-CC(CT) AC(AG) GCC AGI GT(AG) (AT)AI CG(AC) (AG)C(CT) TTG TA-3ÂŽ

Referens

  • Allard, A., B. Albinsson, and G. Wadell (2001). Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis. J Clin Microbiol. 39:498-505