Bilaga 4 Infektionsserologi och antigenpÄvisning-NLI

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Nedre luftvÀgsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005


Infektionsserologi och antigenpÄvisning-NLI

Mycoplasma pneumoniae

Analysprincip/Teststrategi: Ett flertal kommersiella kit finns tillgÀngliga för ELISA-bestÀmning av specifika antikroppar, i de flesta fall riktade mot P1-adhesin. Metoden anses specifik för pÄvisande av NLI orsakad av Mycoplasma pneumoniae.

IgM-antikroppar kan pÄvisas ca 1 vecka efter symtomdebut med maximala nivÄer efter 2-4 veckor. Efter nÄgra mÄnader upp till ett halvÄr sjunker nivÄerna och blir oftast inte lÀngre pÄvisbara. Vid reinfektion uteblir ofta IgM-svar. IgG-antikroppar upptrÀder ca 1 mÄnad efter symtomdebut. Vid uteblivet IgM-svar kan mykoplasmainfektion verifieras genom titerförÀndring av IgG. Vissa tillverkare förordar pÄvisning av IgA-antikroppar för pÄvisande av infektion med mykoplasma, men vÀrdet Àr oklart. IgA-antikroppar upptrÀder oberoende av om det rör sig om en primÀr- eller reinfektion.

Referensera/kontrollsera: PrimÀr kalibrator saknas. Internkontroller för monitorering upparbetas lokalt. LÄgpositiv kontroll tillverkas och bestÀms till börvÀrde och giltighetsomrÄde (+-2 SD) i 20 konsekutiva testkörningar.

Analysprocedur: Nedan beskrivs den antigenbaserade (P1-adhesin) VIRION/SERION ELISA classic Mycoplasma pneumoniae IgG/IgM/IgA som Àr ett vanligt förekommande kommersiellt alternativ. Produkten Àr CE-mÀrkt enligt IVD-direktivet.

Översiktligt gĂ€ller:

  • LĂ€mpliga provtyper Ă€r serum eller plasma (EDTA, citrat, heparin). Skall inte termiskt inaktiveras. Resultaten blir osĂ€kra om proverna Ă€r lipemiska, hemolytiska eller ikteriska.
  • Prover spĂ€ds i spĂ€dningsbuffert 1:100 och blandas vĂ€l.
  • Prover för IgM-pĂ„visning mĂ„ste reumafaktorabsorberas enligt anvisningar (SERION-reumafaktorabsorbans, ref nr Z 200).
  • SpĂ€dda och absorberade prover kan sparas i kyl i en vecka.
  • Kitets kontrollsera Ă€r bruksfĂ€rdiga. Negativ och positiv kontroll inkluderas alltid.
  • Antigen-coatade strips anvĂ€nds för analysen.
  • ELISA-testet genomförs enligt anvisningarna. ExtinktionsmĂ€tning sker vid 405 nm inom 60 minuter efter det att stopplösning tillsatts.

Kvantitativ testutvĂ€rdering sker enligt ”4-parameter logistic-log-modell” varvid fabrikanten (Institut Virion/Serion GmbH, WĂŒrzberg, Tyskland) för varje batch faststĂ€ller standardkurva i flera testkörningar. SĂ€rskilt standardserum ingĂ„r för att bedöma testkörningens kvalitet och Ă€r av fabrikanten Ă„satt ett börvĂ€rde och ett giltighetsomrĂ„de, se dock nedan under kvalitetssĂ€kring.

MĂ€tning/Kalibrering/UtrĂ€kning: I ELISA-metoden presenteras mĂ€tresultatet som ett OD-vĂ€rde. Detta relateras till kitstandardens OD-vĂ€rde, förutsatt att ingĂ„ende kontroller inklusive internkontroll utfallit inom respektive giltighetsomrĂ„de. Patientprovernas mĂ€tvĂ€rden tilldelas antikroppskoncentrationer, U/mL, genom avÂŹlĂ€sning i vĂ€rdetabell. GrĂ€nsvĂ€rdet i IgG-testet bör stĂ€llas in sĂ„ att bara ca 15 % av oselekterade blodgivare bedöms positiva (klinisk cutoff).

KvalitetssĂ€kring: Parade sera testas pĂ„ samma strip. Internkontroll analyseras ocksĂ„ för monitorering av eventuellt systemfel och CV %. Extern kontroll utgörs av kvalitetsutskick via EQUALIS som inkluderar IgG, IgM och IgA. Utbyte minst en gĂ„ng vartannat Ă„r med tvĂ„ andra lab som har samma metod uppsatt.

MĂ€tosĂ€kerhet: Metodens inomdagsvariation (CV) bör ligga < 15 %.

Svarsrutiner: Resultatet anges som U/mL med uppgift om titerförÀndring.

Övrigt: För tolkningar, se i denna bok under Mycoplasma pneumoniae, referensmetodik.


Chlamydophila pneumoniae

AntikroppsbestÀmning mot Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae och psittaci med mikroimmunfluorescens (MIF).

MIF i dess ursprungliga form utvecklades för att bestÀmma antikroppar mot Chlamydia trachomatis men har senare adapterats Àven för C. pneumoniae och C. psittaci. Utöver in-house-metoder finns Àven flera kommersiella test. En utvÀrdering av nÄgra vanliga test har rapporterats (Bennedsen M et al. 2002) dÀr överensstÀmmelsen var god.

De hos oss vanligaste, kommersiella MIF-testen Àr MIFA (AniLabsystems, Helsingfors, Finland) och Chlamydia MIF ( Focus Technologies, Cypress, Ca, USA).

Testet frÄn Focus har valts eftersom de ingÄende antigenen alla behandlats för att avlÀgsna LPS som korsreagerar mellan de olika arterna. Specifik aktivitet mot C. psittaci kan dÀrför Àven bedömas.

PÄ de fÀrdiga glasen finns grupper med tre olika antigen frÄn chlamydia; C. pneumoniae, C. trachomatis och C. psittaci.

Dessutom finns ett negativt antigen frÄn oinfekterade Àgg.

PÄ glasen finns 12 identiska antigengrupper. Glasen inkuberas med serumspÀdningar och efter tvÀttning med anti-human-IgG eller anti-human-IgM. DÀrefter sker avlÀsning med fluorenscensmikroskop.

Testning för IgG-ak mot C. pneumoniae/psittaci:

  • 1. Serum spĂ€des i PBS 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256 och 1/512.
  • 2. 25 ”L av varje serumspĂ€dning placeras pĂ„ en enskild antigengrupp.
  • 3. Kitets negativa och positiva kontroller liksom en ’egen’ driftskontroll i spĂ€dning testas ocksĂ„.
  • 4. Inkuberas i fuktig kammare i 37 ÂșC över natten (vilket avviker frĂ„n fabrikantens rekommendation).
  • 5. Glasen sköljs av med PBS med 0,05 % TWEEN 20 och tvĂ€ttas sedan under omrörning under 10 minuter. Avsköljs med dest.vatten och torkas.
  • 6. 25 ”L anti-human-IgG, fluorescensmĂ€rkt, tillsĂ€tts varje antigengrupp. Glasen inkuberas i 37 ÂșC i 30 minuter. HĂ€refter tvĂ€ttas glasen pĂ„ nytt som ovan i 10 minuter och avsköljs slutligen med dest.vatten. Glasen fĂ„r torka.
  • 7. Monteras med 90 %-ig buffrad glycerol eller sĂ€rskild monteringsvĂ€tska som ingĂ„r i kitet.
  • 8. Glasen avlĂ€ses med fluorescensmikroskop vid 250 – 300 gĂ„ngers förstoring. Varje antigen bedöms. En mĂ€ngd likstora grönlysande organismer kan iakttas vid positiv reaktion. Denna reaktion avtar gradvis i högre spĂ€dning. Slutligen kan lysande organismer endast observeras i kanten av antigenpricken. Provets antikroppstiter anges som det inversa spĂ€dningsteg dĂ„ central uppklarning intrĂ€ffat men perifer fluorescens fortfarande Ă€r klar och tydlig. Endast randfluorescens bör bedömas som negativt.


Testning för IgM-antikroppar mot C. pneumoniae/psittaci:

  • 1. Serum screenas i spĂ€dning 1/16 och 1/64 för IgM-anitkroppar.
  • 2. Positiva sera IgG-absorberas med Gullsorb (Gull laboratories,inc. Salt Lake City, USA).
  • 3. SerumspĂ€dning i PBS görs dĂ€refter enl. följande: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 och 1/640.
  • 4. Kitets kontroller liksom en ’egen’ driftkontroll medtages.
  • 5. Glasen inkuberas över natten som ovan.
  • 6. Sköljes och tvĂ€ttas som ovan samt torkas.
  • 7. Anti-human-IgM, fluorescensmĂ€rkt, tillsĂ€tts sedan och glasen inkuberas i 30 minuter vid 37Âș C.
  • 8. Efter tvĂ€ttning och torkning monteras glasen som ovan och avlĂ€ses i fluorescensmikroskop vid 250 – 300 gĂ„ngers förstoring.


Kvalitetskontroll: Eftersom olika MIF-tester anvĂ€nds av olika laboratorier och dĂ„ nĂ„gon enskild test inte verkar vara överlĂ€gen andra, blir extern kvalitetskontroll betydelsefull för att försöka ensa resultaten. I Sverige finns Ă„rligen Ă„terkommande kvalitetsutskick via EQUALIS AB. Diagnostik av akut infektion av C. pneumoniae prövas dĂ„ i parade eller enskilda sera. Resultaten frĂ„n dessa paneler visar att akut infektion av C. pneumoniae regelmĂ€ssigt pĂ„visas av deltagande laboratorier i parade eller enskilda sera. Specifikt IgM skiljs ocksĂ„ frĂ„n störande reumafaktorer. (Även EIA-metoder klarar dessa paneler).

Eftersom ett standardserum med faststÀlld titer inte finns tillgÀngligt har inget försök gjorts att ensa erhÄllna titrar.


REFERENS

  • Bennedsen M, Berthelsen L, Lind I. 2002. Performance of three microimmunofluorescence assays for detection of Chlamydia pneumoniae immunoglobulin M, G, and A antibodies.Clin Diagn Lab Immunol. 9: 833-9.


Bordetella pertussis

Analysprincip/Teststrategi: Indirekt ELISA för antikroppar mot pertussistoxin (anti-PT) betraktas som specifik för pÄvisande av pertussisinfektion. Serokonversion i antikroppskoncentration mot filamentöst hemagglutinin (anti-FHA) förekommer ocksÄ efter infektion med B. parapertussis och okapslade Haemophilus influenzae. Anti-FHA motiveras av att kinetiken skiljer sig. Anti-PT kommer tidigt och nÄr snabbt en platÄ hos immuniserade medan anti-FHA visar en lÀngre period av antikroppsstegring, vilket rÀtt utnyttjat kan öka sensitiviteten i systemet. Kombinationen anti-FHA stegring och hög men stabil anti-PT talar för pertussis.

NÀstan alla fall med IgA-svar visar samtidig IgG-stegring. Eftersom en nedgÄng för IgA anti-PT kan komma snabbare Àn för IgG anti-PT ökas dock sensitiviteten om Àven IgA inkluderas.

AnvÀndning av pertaktin och fimbrier ger ingen ökad sensitivitet men kan medföra specificitetsproblem.

Referenssera/Kontrollsera: PrimÀr kalibrator Àr Humant antiserum HRP3 (Food and Drug Administration, USA) med 200 arb.EU/mL för IgG anti-PT, 200 arb.EU/mL för IgG anti-FHA och 15 arb.EU/mL för IgA anti-PT (Lynn et al 1996).

Angiven primÀrkalibrator Àr för nÀrvarande svÄrtillgÀnglig. SekundÀr kalibrator SBL IgG 42 kan ocksÄ anvÀndas. Internkontroller för monitorering upparbetas lokalt.

Reagens/Analysprocedur: Antigen har tillhandahÄllits av vaccintillverkarna. MÀtningen utförs i 8 spÀdningssteg för sÄvÀl kalibrator som test- och kontrollsera. Singel point kan anvÀndas i större serier men dÄ förloras den information som kurvans lutning ger. Coatningsdos, bovint serumalbumin , konjugat och buffertar Àr kritiska för jÀmförbarhet och mÄste utprövas lokalt.

MĂ€tning/Kalibrering/UtrĂ€kning: I ELISA-metoden presenteras mĂ€tresultatet som ett OD-vĂ€rde. För att uppnĂ„ spĂ„rbarhet relateras provets uppmĂ€tta OD-vĂ€rde till kalibratorns OD-vĂ€rde. Kalkylering av arbitrĂ€ra enheter (arb.EU/mL) frĂ„n kalibratorn kan ske pĂ„ mĂ„nga olika sĂ€tt. I detta fall anvĂ€nds ”reference line calculation method” (Reizenstein et al.1995) som Ă€r ett sĂ€tt att mĂ€ta det horisontella avstĂ„ndet mellan kalibratorns lutningskurva och en parallellt dragen dosresponskurva representerande provets mĂ€tpunkter.

KvalitetssĂ€kring: Parade testsera analyseras pĂ„ samma platta. Vid sidan av kalibratorn analyseras ocksĂ„ pĂ„ samma platta en internkontroll för monitorering av sĂ„vĂ€l bias som imprecision (CV %). Vid diagnostik anvĂ€nds en kontroll med mĂ€tvĂ€rden centralt i mĂ€tintervallet; för immunitetsstudier dessutom en nĂ€ra mĂ€tomrĂ„dets nedre cutoff. VĂ€rdena införs kontinuerligt i Shewhartdiagram. Acceptanskriterier skall finnas upprĂ€ttade.

MĂ€tosĂ€kerhet: Metodens inomdagsvariation (CV) Ă€r efter omtestningar <15 %.

MĂ€tintervall: För diagnostiskt Ă€ndamĂ„l 12-600 EU/mL. Inom detta mĂ€tomrĂ„de Ă€r CV % stabil.

Övriga prestanda: PT-antikroppar anses specifika för infektion med B. pertussis. För att en titerstegring skall betraktas som sĂ€kerstĂ€lld skall konvalescentserum uppnĂ„ undre grĂ€nsen för mĂ€tintervallet. Inom mĂ€tintervallet kan under givna förutsĂ€ttningar en titerstegring pĂ„ 50 % anses som signifikant.

Svarsrutiner: Resultatet anges som arb.IgG/IgA ELISA-enheter (EU/mL) med uppgift om titerförÀndring.


REFERENSER

  • Lynn, F., G.F. Reed, and B.D. Meade. 1996. Collaborative study for the evaluation of Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assays used to measure human antibodies to Bordetella pertussis antigens. Clin. and Diagn. Lab. Immunol. 3:689-700.
  • Reizenstein, E., H.O. Hallander, W.C. Blackwelder, I. Kuhn, M. Ljungmann, and R. Möllby. 1995. Comparison of five calculation modes for antibody ELISA using pertussis serology as a model. J. Immunol. Methods 183:279-290.

Legionella pneumophila

Analysprincip/teststrategi: Legionellabakterier av olika serotyper och arter fÀsts till objektglas. Patientserum sÀtts till glasen och om serum innehÄller antikroppar (Ak) riktade mot Legionella binder dessa till bakterierna. DÀrefter tillsÀtts FITC-mÀrkta antikroppar specifika för humant immunglobulin. Glasen tvÀttas och monteras och avlÀses i UV-mikroskop. Om antikroppar mot Legionella finns i patientens serum fluorescerar bakterierna.

Antigen för att med indirekt immunfluorescens pÄvisa antikroppar mot Legionella.

VÀrmeavdödat helcellsantigen fixeras pÄ objektglas.

Avdelningen för klinisk mikrobiologi vid akademiska laboratoriet, Akademiska sjukhuset i Uppsala upprÀtthÄller referensmetod för legionellaserologi.

Initialt testas patientsera mot 4 olika bakteriepooler.

  • Pool 1 L. pneumophila serogrupp 2-8.
  • Pool 2 L. longbeachae serogrupp 1 och serotyp 2, L. micdadei och L. bozemanii.
  • Pool 4 L. pneumophila serogrupp 1, subgrupper Philadelphia och Knoxville.
  • Pool 5 L. pneumophila serogrupp 1, subgrupper Olda och Bellingham.

Om initial titer >=1/32 titreras vidare mot enskilda antigener.

MÀtning/kalibrering/utrÀkning:

  • Fluorescensen graderas +, ++, +++.
    • +++ = Starkt lysande grön fluorescens med tydlig bakteriemorfologi.
    • ++ = Lysande grön fluorescens med klar bakteriemorfologi.
    • + = Svagare grön fluorescens men fortfarande tydlig bakteriemorfologi.

Den högsta spÀdning som ger tydlig ++ fluorescens anges som titervÀrde.

KvalitetsÀkring

Intern kontroll: poolat patientserum anvÀnds för att följa metodvariationen. Artspecifika kontrollsera anvÀnds för att kontrollera att antigenen pÄ glasen Àr de rÀtta.

Extern kontroll: Kvalitetsutskick via hÀnvisningslab, panelutbyte med andra laboratorier (dock begrÀnsade möjligheter eftersom endast ett fÄtal laboratorier har metoden uppsatt).

MÀtosÀkerhet: +/- 1 titersteg.

Prestanda

En titerĂ€ndring kan ta flera veckor och Ă€r ibland ej möjlig att med sĂ€kerhet pĂ„visa. IgM kan ibland pĂ„visas tidigt i förloppet, Ă„ andra sidan kan dessa antikroppar kvarstĂ„ under lĂ„ng tid varför fyndet ej Ă€r helt pĂ„litligt. Sensitiviteten har berĂ€knats till 60-80 %, och specificiteten vid infektioner orsakade av Legionella pneumophila sg 1 till ca 95 %. Serologi anses mer opĂ„litlig nĂ€r infektion orsakas av Legionella pneumophila ej-sg 1. För sĂ€ker diagnos krĂ€vs parad serologi med 4-faldig titerförĂ€ndring. Enstaka höga titrar kan vara av vĂ€rde i samband med utredning vid misstĂ€nkt utbrott. Serologi Ă€r dock den enda metod som kan anvĂ€ndas för diagnos av Pontiac-feber eftersom odlingsfynden dĂ„ Ă€r negativa.

Maximalt Ak-svar ses vanligen inom 4-5 veckor efter sjukdomsdebut. 10 % svarar med pĂ„visbara Ak-nivĂ„er först efter > 6 veckors sjukdomsduration. I samband med utbrottet i VĂ€rnamo 1991 (Darelid) noterades att hos 17 av 21 (81 %) kunde en 4-faldig titersĂ€nkning noteras inom 12 mĂ„nader. Uteblivet Ak-svar eller lĂ„gt Ak-svar 32 pĂ„visades hos 9/52 (17 %) av patienterna. Titrar kan kvarstĂ„ upp till 2 Ă„r.

Korsreaktioner vid infektioner med andra gramnegativa bakterier kan ske t.ex. Bacteroides fragilis, Citrobacter, Campylobacter och Pseudomonas. Även Coxiella burnetii kan orsaka korsreaktion.

Svarsrutiner

Negativt prov svaras: Antikroppar mot Legionella med indirekt IF < 1/32.

Prov med lĂ„ga titrar besvaras: Antikroppar mot Legionella i pool 
pĂ„visade i titer 1/32 (poolens innehĂ„ll anges pĂ„ svaret). Prov innehĂ„llande högre titrar besvaras: Antikroppar mot Legionella- (artnamn och serotyp) pĂ„visade i titer
.

Metoder för pÄvisning av antikroppar i serum har ett begrÀnsat vÀrde för akutdiagnostiken eftersom titerförÀndringar mellan tvÄ prov sÀllan kan pÄvisas tidigt. IgM-antikroppar kan dock pÄvisas i tidigt skede efter symtomdebuten. Serologisk provtagning Àr ocksÄ viktig vid uppföljning av misstÀnkta fall vilket dÄ underlÀttas av att serumprov tagits i akutskedet. Vid serokonversion Àr sensitiviteten mÄttlig (ca 0,75) men specificiteten relativt god, >0,95. Enstaka höga titrar kan tala för aktuell sjukdom, sÀrskilt om det samtidigt förekommer andra sÀkerstÀllda fall i omgivningen. Serologisk diagnostik Àr nöjaktigt utvÀrderad endast för infektioner orsakade av L. pneumophila serogrupp 1. Resultat av antikroppstitreringar mot andra serogrupper och legionellaarter Àr dÀrför mindre tillförlitliga.

PĂ„visande av Legionella pneumophila serogrupp 1-antigen i urin

Analysprincip/teststrategi: Kommersiella kit finns tillgÀngliga. Utsöndringen av legionellaantigen i urin kan variera beroende pÄ den individuella patienten, den underliggande sjukdomen och ev. behandling. Utsöndring av antigen kan pÄvisas frÄn 3 dagar efter symtomdebut och i vissa fall vid defekt cellmedierad immunitet kvarstÄ upp emot 1 Är efter genomgÄngen infektion.

Referenssera / kontrollsera: PrimĂ€r kalibrator saknas. Internkontroller för monitorering upparbetas lokalt. LĂ„gpositiv kontroll tillverkas och bestĂ€ms till börvĂ€rde och giltighetsomrĂ„de (+- 2 SD) i 20 konsekutiva testkörningar. Analysprocedur: Nedan beskrivs Legionella urinary antigen EIA binax. Produkten Ă€r CE-mĂ€rkt enligt IVD-direktiv. Metoden bygger pĂ„ ELISA-metodik och pĂ„visar samt kvantifierar mĂ€ngden antigen frĂ„n Legionella pneumophila serogrupp 1 i urinen hos infekterade patienter. Urin sĂ€tts till mikrotiterplattor klĂ€dda med polyklonala kaninantikroppar specifika för L. pneumophila serogrupp 1-antigen. Anti-Legionella-HRP-konjugat tillsĂ€tts samtidigt som provet. Efter inkubation och efterföljande tvĂ€ttning tillsĂ€tts enzymsubstrat och fĂ€rgomslag mĂ€ts i fotometer. Översiktligt gĂ€ller: Testet har endast validerats för urin. Övriga provmaterial (plasma, serum eller andra kroppsvĂ€tskor) som kan innehĂ„lla legionellaantigen har inte utvĂ€rderats.

Alla reagens skall vid anvÀndandet vara rumstempererade.

Kontrollera att det inte finns kristaller i tvÀttvÀtskan. I sÄ fall kan den vÀrmas i 37 °C i 5 minuter.

TvÀttsteget Àr kritiskt. OtillrÀcklig tvÀtt kan orsaka felaktigt resultat. Om absorbansen pÄ den negativa kontrollen Àr >0,100 U mÄste man tvÀtta ytterligare tills absorbansen Àr <0,100 U.

ELISA-testet genomförs enligt anvisningarna. LÀs av absorbansen vid 450 nm.

Vid tveksamt positiva resultat eller vid resultat pÄ grÀnsvÀrdenivÄ kan specificiteten kontrolleras med kokning av urinen i 10 minuter (vissa laboratorier testar om alla positiva prov efter kokning).

MÀtning/Kalibrering/UtrÀkning: Blankens absorbansvÀrde subtraheras frÄn absorbansen pÄ varje övrig brunn. MedelvÀrdena av varje dubbelprov berÀknas. RÀkna sedan ut ett index enligt följande formel (anvÀnd medelvÀrden av dubbelproven):

  • Index = OD positiv kontroll eller OD patientprov
  • OD negativ kontroll

Ett typiskt positivt resultat kan se ut sÄ hÀr:

  • 0,300 (OD) = index 7,5
  • 0,040 (OD)

KvalitetssÀkring: Internkontroll analyseras vid varje analys för monitorering av eventuellt systemfel och CV%. Utbyte bör ske 2 gÄnger Ärligen med tvÄ andra laboratorier. The European Working Group for Legionella Infections (EWGLI) erbjuder ett begrÀnsat kvalitetssÀkringsprogram dÀr olika lÀnders hÀnvisningslaboratorier kan delta. I Sverige deltar de mikrobiologiska laboratorierna vid Akademiska sjukhuset och Karolinska.

Prestanda: Metoden upptĂ€cker bara antigen frĂ„n Legionella pneumophila serogrupp 1. Enligt tillverkaren Ă€r sensitiviteten 97,7 % och specificiteten 100 % (1). Det finns dock undersökningar som visar att andra t.ex. serogrupp 4 och 6 i vissa fall kan ge reaktivitet i snarlik test (2).

MĂ€tintervall

  • OD 0,000 – 3,000.
  • Svarsrutin inklusive referensintervall
    • Prov med index > 4,0 besvaras: Positiv (svaras med berĂ€knat indexvĂ€rde)
    • Prov med index < 2,0 besvaras: Negativ
    • Prov med index = 2-4 besvaras: GrĂ€nsvĂ€rde

Positiva prov telefonbesvaras.

Det immunkromatografiska kitet (binax NOW) som Ă€r lĂ€ttare att hantera praktiskt har uppvisat jĂ€mförbara resultat med binax EIA. Även andra fabrikat finns tillgĂ€ngliga.

AnmÀrkning: Positivt fynd skall anmÀlas enligt smittskyddslagen.

REFERENSER

  • Produktblad till Legionella Urinary Antigen, Binax.
  • Kohler R., Wheat J., French M., Meenhorst P., Winn W., Edelstein P. 1985. Cross- reactive urinary antigens among patients infected with Legionella pneumophila sergroups 1 and 4 and the Leiden 1 strain. J Infect Dis. 152: 1007-1012.
  • Yzerman PF, den Boer JW, Lettinga KD, Schellekens J, Dankert J, Peeters M. 2002. Sensitivity of three urinary antigen tests associated with clinical severity in a large outbreak of legionnairesÂŽ disease in the Netherlands. 40: 3232-3236.

PĂ„visande av S. pneumoniae antigen i urin (ej referensmetodik)

Bakgrund: Ett nyutvecklat immunokromatografiskt test (ICT) för snabb identifiering av pneumokock C-polysackarid (PnC, cellvÀggsantigen) i urinprov har visats ha hög kÀnslighet för detektion av pneumokockinfektion i lungorna. Metoden har högre kÀnslighet Àn pÄvisande av pneumokockantigen i urin med EIA, motströmselfores eller latexagglutination. Testet Àr avsett att anvÀndas som ett snabbdiagnostiskt komplement till de konventionella diagnostiska metoder som beskrivs i denna bok. Ett positivt testresultat med ICT anses korrelera vÀl till sjukdom hos vuxna. Hos barn finns risk för genomslag av koloniserande flora i övre luftvÀgarna. Förekomst av PnC i urin korrelerar inte till bakteremi.

Referensmaterial: PrimĂ€r kalibrator saknas. Positiv internkontroll tillverkas lokalt genom att spĂ€da positiv patienturin 1:100. Kontrollen förvaras fryst i –20 ÂșC. Negativ internkontroll tillverkas pĂ„ motsvarande sĂ€tt. Utbyte av positiv kontroll bör ske Ă„rligen med tvĂ„ andra laboratorier.

Analysprocedur: Nedan beskrivs ICT, Binax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test som Àr godkÀnt av FDA och CE-mÀrkt enligt IVD-direktivet.

Kanin IgG-antikroppar mot PnC och get-anti-kanin IgG-antikroppar (kontroll) Àr adsoberade (immobiliserade) pÄ varsin linje pÄ ett nitrocellulosamembran (strip). Ytterligare kanin anti-PnC-antikroppar konjugerade till kolloidala guldpartiklar Àr adsorberade till ett fibröst stroma som Àr anslutet till membranet.

Analysen utförs enligt fabrikantens anvisningar. I korthet sÀtts urinprovet till stromat via medföljande fiberarmerad provtagningspinne. Buffertlösning (citrat/fosfat buffert med NA-laurylsulfat, Tween 20 och Na-azid) tillsÀtts för att lösa ut provet frÄn pinnen varvid detta sprids över membranet.

AvlÀsning: Guldpartikel-konjugatet binder befintliga PnC i provet till ett antigen-antikroppskomplex som i sin tur binds till de immobiliserade anti-PnC-antikropparna i membranet varvid en rosafÀrgad linje framtrÀder.

De immobiliserade get-anti-kanin-IgG antikropparna i membranet binder överskottet av konjugerade antikroppar varvid befintlig blÄ linje blir rosafÀrgad.

Resultatet bedöms som positivt om tvÄ rosa linjer enligt ovan upptrÀder inom 15 minuter. Om bara kontrollinjen upptrÀder bedöms provet som negativt. Resultatet Àr ogiltigt om kontrollinjen bibehÄller sin ursprungliga blÄa fÀrg.

I tveksamma fall anger tillverkaren att förnyad avlÀsning kan ske upp till en timme efter provapplikation.

MÀtning/utrÀkning: Ej aktuellt.

KvalitetssÀkring: Med kitet följer positiv kontroll (vÀrmeinaktiverade pneumokocker) och negativ dito pÄ fiberarmerad pinne. Vi rekommenderar dock att interna kontroller anvÀnds vid sÄvÀl batchkontroll som fortlöpande testkontroll.

Prestanda: Analytisk sensitivitet: Det anges av tillverkaren att testet upptÀcker flertalet relevanta pneumokockserotyper; sÄledes har det visats ge positivt resultat för 23 serotyper av S. pneumoniae i koncentration 10^5 CFU/mL. Uppges tÄla spÀdning av positiv patienturin upp till 1:200, dock vid ospecificerad mÀngd antigen. Analytisk specificitet: Korsreaktivitet föreligger med antigen frÄn S. oralis och S. mitis.

Diagnostisk sensitivitet anges till drygt 80 % av tillverkaren. I en undersökning av Kanavaki et al, 2002, var testet positivt i 14 av 66 fall av samhĂ€llsförvĂ€rvad pneumoni hos vuxna. Motsvarande sputumodling var positiv för pneumokocker i endast 2 fall och blododling i endast 1 fall.

Diagnostisk specificitet anges till 97,2 % baserat pĂ„ kliniska studier av samhĂ€llsförvĂ€rvad pneumoni liksom undersökning av urin hos friska personer. Detaljerad listning betrĂ€ffande klinisk korsreaktivitet finns i produktinstruktionerna.

Svarsrutin: Positivt test kan besvaras: DirektpÄvisning av pneumokockantigen i urin: Positiv.


REFERENS

  • Kanavaki, S., Karabela, S., Makarona, M., Triantafillou, S., Efstathiadou, E. and Faviou, E. 2002. Alternative microbiological methods for the diagnosis of pneumococcal pneumonia. Pneumon. 15;196-201.


Direkt immunfluorescens; virologiska agens

En direkt immunfluorescensmetod för antigenpÄvisning av virologiska agens i infekterade celler frÄn luftvÀgarna.

Analysprincip: AntigenpÄvisning med direkt immunfluorescens (IF)-teknik. Kvalitativ test för pÄvisning av virologiska agens i celler frÄn luftvÀgar med hjÀlp av antikroppar. Reagens och kontroller: Reagens innehÄller antikroppar konjugerade till ett fluorescerande Àmne.

Kontroller utgörs av fixerade infekterade resp. oinfekterade celler.

  • Utförande
    • 1. Centrifugera inskickat nasofarynxaspirat i rumstemperatur 10 min 380 g = 1500 RPM. Vid liten provmĂ€ngd kan aspiratet spĂ€das i PBS till ca 2,5 mL.
    • 2. TillsĂ€tt 5-10 mL PBS till röret med pelleten, avlĂ€gsna slemklumpar och centrifugera 10 min 380 g = 1500 RPM. Sug av och kasta överfasen.
    • 3. Suspendera cellpelleten i ca 200 ÎŒL PBS och överför en droppe suspension med engĂ„ngspipett till mĂ€rkta objektsglas.
    • 4. Lufttorka preparaten, ca 2 minuter.
    • 5. Fixera i aceton 10 minuter.
    • 6. LĂ„t preparaten lufttorka. Preparaten Ă€r nu klara.
    • 7. Tag ut monoklonala antikroppar och monteringsvĂ€tska ur kylen sĂ„ att de hinner anta rumstemperatur innan de anvĂ€nds för fĂ€rgning.
    • 8. LĂ€gg glasen i en fuktig kammare.
    • 9. FĂ€rga glasen med konjugerade monoklonala antikroppar.
    • 10. Inkubera, i den fuktiga kammaren, 15 minuter i termostat, 34 ÂșC-38 ÂșC.
    • 11. Skölj glasen genom att hĂ€lla PBS i petriskĂ„len. LĂ„t glasen ligga 2 minuter. HĂ€ll av PBS och upprepa proceduren. LĂ„t glasen lufttorka.
    • 12. Montera glasen med monteringsvĂ€tska och med tĂ€ckglas.
    • 13. LĂ€s av glasen i fluroscensmikroskop.

Bedömning: AvlÀsning sker i fluorescensmikroskop vid 200x och /eller 400x förstoring. Hela cellmattan avlÀses.

Endast erfaren personal avlĂ€ser och bedömer IF-fĂ€rgade preparat. För PÅVISAT resultat rĂ€cker det att en typiskt fĂ€rgad cell identifieras. För ej pĂ„visat resultat krĂ€vs inspektion av minst 50 st negativa celler.

KvalitetssÀkring: Deltagande i externa kvalitetskontrollprogram.

MĂ€tosĂ€kerhet: KĂ€nsligheten Ă€r avhĂ€ngig av flera parametrer bl. a. provtagningsmtetodik, provglasets kvalitet samt nĂ€r i sjukdomsförloppet provtagningen sker. SĂ„ledes kan sensitiviteten uppskattningsvis variera mellan 60-100 %.