Bilaga 5. Clostridium difficile-cytotoxin;analysprocedur

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel Clostridium difficile

SekundÀrartikel till Clostridium difficile-laboratoriediagnostik



Clostridium difficile-cytotoxin; analysprocedur

  • Dag 1
    • Cirka 0,5 mL feces blandas vĂ€l med ca 2,5 mL fosfatbuffrad NaCl (PBS).
    • Centrifugera (minst 20 min vid 1000-1100 g, eller 5-10 min vid 13000-14000 g).
    • För över supernatanten (ospĂ€tt prov) till ett tomt rör. Om provet ser grumligt ut filtreras det genom sterilfilter, 0,45 ”m.
    • SpĂ€d provet 1/5 och 1/50 i PBS (t.ex. 1/5 100 ”L ospĂ€tt prov till 400 ”L).
    • Kontrollera att cellerna Ă€r bra (ej upprundade och ett enkelt, jĂ€mnt skikt av celler).
    • Sug av mediet frĂ„n det antal brunnar (2 per prov) som skall anvĂ€ndas i cellplattan, inklusive brunnar för negativ och positiv kontroll.
    • TillsĂ€tt 100 ”L uppehĂ„llsmedium i de tömda brunnarna.
    • TillsĂ€tt 100 ”L av respektive provspĂ€dning (ProvspĂ€dningarna i brunnarna Ă€r nu 1/10 och 1/100).
    • Inkubera plattan vid 37 °C i 3-10 % CO2 över natt.

Positiv kontroll utgörs av C. difficile-toxin, spÀtt enligt tillverkarens instruktioner. Det spÀdda toxinet behandlas som fecessupernatant (ospÀtt prov).

Negativ kontroll. PBS anvÀnds som negativ kontroll.

  • Dag 2
    • Om provet bedöms som positivt i första eller bĂ„da spĂ€dningarna, eller Ă€r svĂ„rt eller omöjligt att bedöma, t.ex. om cellerna Ă€r upplösta eller hopklumpade görs neutralisationstest.
    • Neutralisationstest. Vid neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin görs en titrering av fecessupernatanten för semikvantitering av toxinhalten.
    • Antitoxin. C. difficile-antitoxin spĂ€ds och förvaras enligt tillverkarens instruktioner.
      • SpĂ€d fecessupernatanten (det ospĂ€dda provet) 1/1,25, 1/12,5, 1/125, 1/1250 och 1/12500 i PBS (t.ex. 1/1,25, 200 ”L till 50 ”L PBS).
      • Gör antitoxin provspĂ€dningar och PBS-provspĂ€dningar i en mikrotiterplatta:
        • Antitoxin provspĂ€dningar:
        • Till vardera 3 brunnar i mikrotiterplattan sĂ€tts 50 ”L C. difficile-antitoxin.
        • TillsĂ€tt 50 ”L provspĂ€dning frĂ„n spĂ€dning 1/1,25, 1/12,5 och 1/125 till de 3 brunnarna. SpĂ€dningarna Ă€r nu 1/2,5, 1/25 och 1/250.
    • PBS-provspĂ€dningar
      • Till vardera 5 brunnar i mikrotiterplattan sĂ€tts 50 ”L PBS med mikropipett.
      • TillsĂ€tt 50 ”L av samtliga provspĂ€dningar till de 5 brunnarna.
      • LĂ„t antitoxin provspĂ€dningarna och PBS-provspĂ€dningarna stĂ„ i rumstemperatur 20-30 minuter.
        • Kontrollera att cellerna Ă€r bra.
        • Sug av mediet frĂ„n 8 brunnar per prov i cellplattan, samt 8 brunnar för positiv kontroll och 1 brunn för den negativ kontroll.
        • SĂ€tt 150 ”L uppehĂ„llsmedium till varje brunn.
        • SĂ€tt 50 ”L av respektive PBS/provspĂ€dning (5 st) och antitoxin/provspĂ€dning (3 st) till brunnarna. De slutliga PBS/prov-spĂ€dningarna Ă€r nu 1/10, 1/100 osv., till 1/100.000 och de slutliga antitoxin/provspĂ€dningarna 1/10, 1/100 och 1/1000.
        • Positiv kontroll titreras och neutraliseras som fecessupernatant. Negativ kontroll som vid provsĂ€ttning.
        • Inkubera plattan i 3–10 % CO2 över natt.


AvlÀsning

Toxintester avlĂ€ses i konverterat mikroskop. ToxinpĂ„verkade celler Ă€r upprundade med karakteristiska taggar. Om minst 50 % av cellerna i brunnen Ă€r pĂ„verkade, bedöms denna spĂ€dning som positiv. Specificiteten konfirmeras med neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin före slutlig besvaring.

Toxintest bedöms som korrekt utförd om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen Ă€r opĂ„verkade och minst 50 % av cellerna i den positiva kontrollens brunnar Ă€r pĂ„verkade.

Neutralisationstest bedöms som korrekt utförd om den cytopatogena effekten i den positiva kontrollen neutraliserats i antitoxinspÀdningarna och om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen Àr opÄverkade.


PreliminÀr avlÀsning av toxintest

PreliminÀr avlÀsning av toxintest görs efter inkubering över natt. Toxintest som preliminÀrt bedöms som negativ inkuberas ytterligare 1 dygn. Om toxintest bedöms som positiv i första eller bÄda spÀdningarna, eller Àr svÄr att bedöma görs neutralisationstest.


Slutlig avlÀsning av toxintest

Slutgiltig avlÀsning av negativ toxintest görs efter 2 dygns inkubering.

Om toxintest som preliminÀrt bedömts som negativ bedöms som positiv i en eller bÄda spÀdningarna eller Àr svÄr att bedöma görs en titrering och neutralisationstest av provet.


Slutlig avlÀsning av neutralisationstest

Positiv neutralisationstest avlÀses slutgiltigt efter inkubering över natt.

Neutralisationstest som Àr negativ efter inkubering över natt, avlÀses slutgiltigt efter 2 dygns inkubering, som antingen negativ eller positiv.