Bilaga 5. Clostridium difficile-cytotoxin;analysprocedur

Sekundärartikel till Clostridium difficile-laboratoriediagnostik

Clostridium difficile-cytotoxin; analysprocedur[redigera]

Dag 1
- Cirka 0,5 mL feces blandas väl med ca 2,5 mL fosfatbuffrad NaCl (PBS).
- Centrifugera (minst 20 min vid 1000-1100 g, eller 5-10 min vid 13000-14000 g).
- För över supernatanten (ospätt prov) till ett tomt rör. Om provet ser grumligt ut filtreras det genom sterilfilter, 0,45 µm.
- Späd provet 1/5 och 1/50 i PBS (t.ex. 1/5 100 µL ospätt prov till 400 µL).
- Kontrollera att cellerna är bra (ej upprundade och ett enkelt, jämnt skikt av celler).
- Sug av mediet från det antal brunnar (2 per prov) som skall användas i cellplattan, inklusive brunnar för negativ och positiv kontroll.
- Tillsätt 100 µL uppehållsmedium i de tömda brunnarna.
- Tillsätt 100 µL av respektive provspädning (Provspädningarna i brunnarna är nu 1/10 och 1/100).
- Inkubera plattan vid 37 °C i 3-10 % CO₂ över natt.

Positiv kontroll utgörs av C. difficile-toxin, spätt enligt tillverkarens instruktioner. Det spädda toxinet behandlas som fecessupernatant (ospätt prov).

Negativ kontroll. PBS används som negativ kontroll.

Dag 2
- Om provet bedöms som positivt i första eller båda spädningarna, eller är svårt eller omöjligt att bedöma, t.ex. om cellerna är upplösta eller hopklumpade görs neutralisationstest.
- Neutralisationstest. Vid neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin görs en titrering av fecessupernatanten för semikvantitering av toxinhalten.
- Antitoxin. C. difficile-antitoxin späds och förvaras enligt tillverkarens instruktioner.
  - Späd fecessupernatanten (det ospädda provet) 1/1,25, 1/12,5, 1/125, 1/1250 och 1/12500 i PBS (t.ex. 1/1,25, 200 µL till 50 µL PBS).
  - Gör antitoxin provspädningar och PBS-provspädningar i en mikrotiterplatta:
    - Antitoxin provspädningar:
    - Till vardera 3 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL C. difficile-antitoxin.
    - Tillsätt 50 µL provspädning från spädning 1/1,25, 1/12,5 och 1/125 till de 3 brunnarna. Spädningarna är nu 1/2,5, 1/25 och 1/250.
- PBS-provspädningar
  - Till vardera 5 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL PBS med mikropipett.
  - Tillsätt 50 µL av samtliga provspädningar till de 5 brunnarna.
  - Låt antitoxin provspädningarna och PBS-provspädningarna stå i rumstemperatur 20-30 minuter.
    - Kontrollera att cellerna är bra.
    - Sug av mediet från 8 brunnar per prov i cellplattan, samt 8 brunnar för positiv kontroll och 1 brunn för den negativ kontroll.
    - Sätt 150 µL uppehållsmedium till varje brunn.
    - Sätt 50 µL av respektive PBS/provspädning (5 st) och antitoxin/provspädning (3 st) till brunnarna. De slutliga PBS/prov-spädningarna är nu 1/10, 1/100 osv., till 1/100.000 och de slutliga antitoxin/provspädningarna 1/10, 1/100 och 1/1000.
    - Positiv kontroll titreras och neutraliseras som fecessupernatant. Negativ kontroll som vid provsättning.
    - Inkubera plattan i 3–10 % CO₂ över natt.

Avläsning[redigera]

Toxintester avläses i konverterat mikroskop. Toxinpåverkade celler är upprundade med karakteristiska taggar. Om minst 50 % av cellerna i brunnen är påverkade, bedöms denna spädning som positiv. Specificiteten konfirmeras med neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin före slutlig besvaring.

Toxintest bedöms som korrekt utförd om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade och minst 50 % av cellerna i den positiva kontrollens brunnar är påverkade.

Neutralisationstest bedöms som korrekt utförd om den cytopatogena effekten i den positiva kontrollen neutraliserats i antitoxinspädningarna och om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade.

Preliminär avläsning av toxintest[redigera]

Preliminär avläsning av toxintest görs efter inkubering över natt. Toxintest som preliminärt bedöms som negativ inkuberas ytterligare 1 dygn. Om toxintest bedöms som positiv i första eller båda spädningarna, eller är svår att bedöma görs neutralisationstest.

Slutlig avläsning av toxintest[redigera]

Slutgiltig avläsning av negativ toxintest görs efter 2 dygns inkubering.

Om toxintest som preliminärt bedömts som negativ bedöms som positiv i en eller båda spädningarna eller är svår att bedöma görs en titrering och neutralisationstest av provet.

Slutlig avläsning av neutralisationstest[redigera]

Positiv neutralisationstest avläses slutgiltigt efter inkubering över natt.

Neutralisationstest som är negativ efter inkubering över natt, avläses slutgiltigt efter 2 dygns inkubering, som antingen negativ eller positiv.