Bilaga 5 (CNS)

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet


Bilaga 5

Enterovirus: Isolering enligt metod frÄn Virusavdelningen, Huddinge sjukhus

Reagens

Isolering

  • Rundbottnade rör med nĂ€stan konfluerande cellmatta anvĂ€nds. Cellerna kan företrĂ€desvis vara GMK (Green Monkey Kidney)-celler i kombination med RD (Rhabdomyosarkom)-celler.
  • Före tillsĂ€ttningen av likvor till röret avsugs utvĂ€xtmediet och ersĂ€tts med 1.5 mL uppehĂ„llsmedium som kan bestĂ„ av 80% Medium 199 (Parker) + 20% tryptosfosfatbuljong med tillsats av 2% fetalt kalvserum.
  • Till varje cellrör ympas 0,2-0,4 mL likvor beroende pĂ„ mĂ€ngd insĂ€nt material. Om mycket litet provmaterial erhĂ„llits kan isoleringsförsök göras Ă€ven pĂ„ sĂ„ lite som 0,05 mL. KĂ€nsligheten blir dĂ„ lĂ€gre.
  • Rören fĂ„r sedan ligga horisontellt och snurra kontinuerligt i inkubator hĂ„llande 36-37 °C.
  • Isoleringsförsöket pĂ„gĂ„r under 14 dagar och under den tiden inspekteras cellmattan 2 ggr/vecka i ljusmikroskop för att notera ev cytopatogen effekt. Inititalt ses en upprundning av cellerna vilka sedan lossnar och blir smĂ„ fragmentariska bitar som flyter runt i mediet.

Verifiering

  • Vid cytopatogen effekt bör passage göras för att bekrĂ€fta att effekten pĂ„ cellmattan orsakas av replikerande virus och ej Ă€r toxisk till sin natur.
  • Vid passage tas 0,1 mLav materialet i det positiva röret och sĂ€tts till ett nytt cellrör pĂ„ samma sĂ€tt som vid ursprungsisoleringen.
  • Passagen avlĂ€ses dagligen i ljusmikroskop. Vid total cytopatogen effekt typisk för enterovirus ges följande svar: cytopatogent agens pĂ„visat - sannolikt enterovirus.
  • Det isolerade materialet förvaras vid -20 °C i vĂ€ntan pĂ„ typning.

För vissa coxsackie A-typer krÀvs isolering pÄ nyfödda babymöss. SÄdan utförs endast undantagsvis, varför metoden ej beskrivs hÀr.

Typning

Typning av enterovirusisolat, vilket ocksÄ ger den definitiva bekrÀftelsen pÄ att ett enterovirus isolerats, kan göras enligt tvÄ olika principer; med komplementbindningstest och med neutralisationstest.

För komplementbindningstest anvÀnds typspecifika antisera som framstÀllts i marsvin. I en 96-hÄlsplatta sÀtts en droppe antiserum till varje brunn (olika serotyper i olika hÄl). DÀrefter tillsÀtts 2 droppar av den virusskörd man önskar typa. Inkubering sker över natt i nÀrvaro av komplement och dagen efter tillsÀtts det hemolytiska systemet och plattan avlÀses. Med tillgÄng till marsvinsantisera kan serotypning ske inom tvÄ arbetsdagar.

För att rationalisera typning med neutralisations (NT)-test finns pooler med typspecifika antisera. Dessa togs fram av Lim och Benyesh-Melnick och kallas dÀrför LBM-pOoler. Det finns allt som allt 15 olika pooler. De 8 första poolerna (A-H9) tÀcker in de 42 serotyper som oftast isoleras i cellkultur. 100 Tissue culture infectious doses (TCID)50/0,1 mL av virusisolatet inkuberas med lika stor volym (20 units) av serumpoolen. Virus-serumblandningen ympas sedan pÄ cellrör vilka inkuberas pÄ samma sÀtt som vid primÀr isolering. AvlÀsning sker 2-3 ggr under 10 dagar. Beroende pÄ vilka pooler som neutraliserat virus kan den aktuella serotypen utlÀsas med hjÀlp av ett schema.