Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad april 2012. InnehÄllet preliminÀrt i vÀntan pÄ konsensusförfarande


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner


Biokemiska referenssubstrat för identifiering av Salmonella, Shigella och Yersinia i rutindiagnostiken

AllmÀnt

Nedan beskrivna substrat kombineras till ett testbatteri lÀmpat för primÀr diagnostik av Salmonella, Shigella och Yersinia. Referenskombination för diagnostiken Àr Mannitolrör med Durhamrör, medier för pÄvisning av Lysindekarboxylas och H2S-produktion, Urea och ONPG/indol. Batteriet kan kompletteras med substrat för pÄvisande av ornitindekarboxylas (OD) som Àr anvÀndbart vid misstanke om Salmonella Typhi som bland Salmonellae Àr ensam att vara OD-negativ. Diagnosen Shigella sonnei stÀrks av pÄvisandet av OD-positivitet, övriga Shigellae Àr OD-negativa.

Medium med D-mannitol

Medium för differentiering av arter inom Enterobacteriaceae som pÄvisar förmÄga att degradera D-mannitol (en av sex naturligt förekommande sockeralkoholer med sex kolatomer) med eller utan gasutveckling.

Bakterier inom familjen kan utnyttja mannitol som kol-och energikÀlla. Mannitol internaliseras i bakteriecellerna och fosforyleras genom ett mikrobiellt fosfotransferassystem. DÀrefter sker en enzymatisk konvertering via ett dehydrogenas varvid molekylen omvandlas till D-fruktos under syrabildning. D-fruktos metaboliseras sedan vidare under avgivande av metabol energi. Vid processen bildar vissa mikroorganismer ocksÄ gas, vilket kan studeras genom att i jÀsningsröret applicera ett Durham-rör.


Typrecept medium med D-mannitol

InnehÄll MÀngd
BACTO Pepton 10,0g
NaCl 5,0g
di-Na-vÀtefosfat-dihydrat 5,0g
BromtymolblÄtt 2g/kg 12,0 mL
D-Mannitol Analytical Reagent 5,0g


SĂ€tts till RO-vatten, 1000mL

pH justeras till 7,4+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör med Durhamrör

HĂ„llbarhet: 4 veckor i kyl

  • Kontrollstammar
    • Escherichia coli, CCUG 17620
    • Proteus mirabilis, CCUG 26767


Lysindekarboxylas (LD)- och H2S-medier

Medier för pÄvisande av lysindekarboxylasaktivitet och H2S-bildning hos bakterier tillhörande Enterobacteriaceae. Förekomst av bÄde lysindekarboxylas och enzymsystem för att reducera tiosulfat eller sulfit till H2S (flera gener, phs, chlA, och menB, Àr involverade) Àr en framtrÀdande egenskap hos mÄnga Salmonellae, men kan ocksÄ förekomma hos andra bakteriearter.

Bakterier som producerar lysindekarboxylas dekarboxylerar aminosyran lysin i mediet under bildandet av basiska produkter (frÀmst kadaverin). LD-buljongen antar dÄ lila fÀrg (beroende pÄ vilken indikator som anvÀnds). För bakterier som saknar LD förblir mediet surt (gulfÀrgat) beroende pÄ bakteriernas metabolism. Kommersiella buljonger finns tillgÀngliga. Lysinet i mediet kan bytas mot ornitin för pÄvisande av ortnitindekarboxylas (OD).

Ett traditionellt referensmedium för pÄvisande av H2S-bildning hos bakterierna Àr kombinationsmediet Triple Sugar Iron (TSI)-agar som kan tillverkas som snedagar i buljongrör. Mediet innehÄller glukos (sÄvÀl syrabildning som gasproduktion kan pÄvisas i botten av röret), laktos och sukros (fÀrgar i förekommande fall hela mediet gult av bakteriemetabolism). Produktion av H2S genom reduktion av tiosulfat framtrÀder som svÀrta i mediet. Kommersiella buljonger finns tillgÀngliga.

Kombinationsmedium (Lysindekarboxylas (LD)-buljong med jÀrn-ammoniumsulfat och tiosulfat) kan anvÀndas för att pÄvisa samtidig förekomst av lysindekarboxylas-och sulfhydrasaktivitet hos Salmonella. Mediets pH höjs beroende pÄ LD-aktiviteten, sÀrskilt effektivt om reaktionen sker anaerobt (för att undvika pH-sÀnkning orsakad av bakteriens aeroba metabolism). Om bakterien samtidigt producerar vÀtesulfid (H2S) frÄn tiosulfatet, kan detta reagera med jÀrnet och bilda en svart, svÄrlöslig jÀrnsulfid. Om bakterien inte producerar lysindekarboxylas sjunker mediets pH successivt beroende pÄ glukosmetabolism och antar en gul fÀrg. Mediet förblir dÄ gult Àven om bakterierna har sulfhydrasaktivitet. Nedan visas recept för ett kombinationsmedium.


Kombinationsmedium för pÄvisning av LD-H2S

InnehÄll MÀngd
LD-buljong (kommersiell) 14,0g
Agar-granulat 6,0g
ammonium-jÀrn(II)-sulfat-hexahydrat 0,2g
Na-tiosulfat-pentahydrat 0,2g
NaCl 5,0g


SĂ€tts till RO-vatten, 1000mL

pH justeras till 6,1+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör

HĂ„llbarhet: 4 veckor i kyl

  • Kontrollstammar
    • Escherichia coli, CCUG 17620
    • Proteus mirabilis, CCUG 26767
    • Salmonella Typhimurium, CCUG 31969

Urea-buljong

Medium för differentiering av gramnegativa stavar.

Vissa bakterier producerar enzymet ureas (bland andra Proteaee, Yersinia spp), vilket hydrolyserar urinÀmne under bildning av ammoniak och koldioxid. Ammoniak löser sig i mediet som blir basiskt varvid nÀrvarande indikator (fenolftalein) slÄr om till rött.

Omvandling av urea till ammoniak via mikrobiellt ureas


Typrecept Urea-buljong

InnehÄll MÀngd
Pepton 14,0g
Glukos 6,0g
Di-natrium-fosfat 0,2g
Kalium-dihydrogen-fosfat 0,2g
NaCl 5,0g
Fenolrött 0,004g
Urea 40 % 1 ampull (5 mL)/95, 0 mL medium


SĂ€tts till RO-vatten, 950mL

pH justeras till 6,8+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör

HĂ„llbarhet: 4 veckor i kyl

  • Kontrollstammar
    • Escherichia coli, CCUG 17620
    • Proteus mirabilis, CCUG 26767

ONPG-Indol-medium

Oto-nitrofenyl-ÎČ-galaktosid (ONPG) Ă€r en substans som kan anvĂ€ndas för detektion av beta-galaktosidaseaktivitet hos bakterier. Enzymet hydrolyserar ONPG-molekylen till galaktos och orto-nitrofenol, den senare molekylen gulfĂ€rgar mediet. Beta-galaktosidas krĂ€vs för att bakterier ska kunna hydrolysera laktos som Ă€r det egentliga mĂ„lsubstratet för enzymet. För att kunna hydrolysera laktos krĂ€vs att detta internaliseras i bakterierna, vilket sker via ett mikrobiellt permeas som finns hos mĂ„nga medlemmar av familjen Enterobacteriaceae. Dessa blir dĂ„ i testsystem laktospositiva. Vissa bakterier saknar permeas och Ă€r dĂ„ laktosnegativa, men kan Ă€ndĂ„ vara ONPG-positiva. Exempel Ă€r mĂ„nga stammar av Salmonella arizonae. De flesta övriga Salmonellae Ă€r sĂ„vĂ€l laktos som ONPG-negativa.

Till mediet kan ocksÄ sÀttas aminosyran L-tryptofan som utnyttjas för pÄvisandet av indolproduktion. Positiv indoltest Àr klassisk för E. coli men förekommer Àven hos andra bakterier. Bakteriellt tryptofanas-enzym deaminerar tryptofan under bildande av indol, pyrodruvsyra och ammoniak. Indolet pÄvisas med en kemisk reaktion mellan indol och p-dimetylaminobenzaldehyd (ingrediens i Kovacs reagens som finns kommersiellt tillgÀnglig), varvid vid lÄgt pH ett rött fÀrgÀmne, rosindol, bildas.


Typrecept ONPG-Idol-medium

InnehÄll MÀngd
2-nitrofenol-beta-D-galaktopyranosid 1,5g
di-natriumvÀtefosfat-dihydrat 0,447g
neutraliserad bakteriologisk pepton 7,5g
NaCl 3,75g
L-tryptofan 0,75g


SĂ€tts till RO-vatten, 1000mL

pH justeras till 7,4+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör

HĂ„llbarhet: 4 veckor i kyl

  • Kontrollstammar
    • Escherichia coli, CCUG 17620
    • Proteus mirabilis, CCUG 26767

REFERENSER

  • Marie-Louise Danielsson-Tham. NĂ„gra vanliga biokemiska tester inom bakteriologin. Andra reviderade upplagan. Publicerad 1985.
  • Flera tillkommer...