CNS-infektioner-primÀr diagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet


PrimÀr diagnostik

OmhÀndertagande av likvor pÄ laboratoriet

Detta avsnitt omfattar centrifugering, mikrobiologisk och kemisk snabbanalys samt inokulering för primÀrisolering. (Se ocksÄ Fig 13.)


Centrifugering

  • Klar likvor: Vid lĂ„ga bakterietal ökar sannolikheten att pĂ„visa bakterier om materialet koncentreras. Vid meningit kan bakteriekoncentrationen vara sĂ„ lĂ„g som 10 CFU/mL. NĂ€r mer Ă€n 0,5 mL likvor finns tillgĂ€ngligt kan materialet dĂ€rför centrifugeras minst 15 min vid 1500-2500 x g. Bottensatsen anvĂ€nds för inokulering av plattor och direkt mikroskopi, alternativt sugs supernatet först av (lĂ€mna ca 0,5 mL) och överförs till ett sterilt rör. Sedimentet blandas vĂ€l med Vortex eller pipett.

Koncentrering genom direktcentrifugering pÄ objektglas (cytospin) ökar chansen att observera bakterier 100-faldigt jÀmfört med ocentrifugerad eller konventionellt centrifugerad likvor (1000 x g, 15 min).

  • Grumlig likvor: Vid höga bakterietal kan fĂ€rgning av ocentrifugerad likvor vara att föredra dĂ„ den rika cellförekomsten annars kan skymma bakterierna.


Direktmikroskopi

Bottensats eller likvor appliceras pÄ 2-3 rena objektglas. Glasen lufttorkas. Fixering med metanol bevarar leukocyterna bÀst. Försiktig vÀrmefixering över gaslÄga gÄr ocksÄ bra.

  • A) GramfĂ€rgning: Bakterier fĂ€rgas grampositivt eller gramnegativt beroende pĂ„ skillnader i mĂ€ngden peptidoglykan. Grampositiva arter har ett tjockt peptidoglykanskikt och relativt stora mĂ€ngder teikonsyra. Peptidoglykanet komplementbinderjod och kristallviolett vilket förhindrar avfĂ€rgning med alkohol. Grampositiva bakterier behĂ„ller dĂ€rför den blĂ„violetta ursprungsfĂ€rgen, om deras cellvĂ€gg inte Ă€r skadad genom Ă„lder, antibiotika eller andra faktorer. CellvĂ€ggen hos gramnegativa arter har ett tunt peptidoglykanlager fĂ€st pĂ„ LPS. Det yttre membranet skadas av alkoholen och tillĂ„ter kristallviolett-jodkomplexet att lĂ€cka ut och ersĂ€ttas av kontrastfĂ€rgen karbolfuchins röda fĂ€rg. För teknisk beskrivning se Bilaga 1.
  • B) AkridinorangefĂ€rgning: Akridinorange Ă€r en fluorokrom som tas upp av nukleinsyra. Bakterierna framtrĂ€der med en orange fĂ€rg vid lĂ„gt pH (4,0) mot en bakgrund av humana cellkĂ€rnor och vĂ€vnadsfragment som har en gulorange fĂ€rg. DetektionsgrĂ€nsen anges till 10^4 CFU/mL. AvlĂ€sning kan ske vid 400x förstoring. Ett akridinorangefĂ€rgat preparat kan anvĂ€ndas för gramfĂ€rgning utan föregĂ„ende avfĂ€rgning.
  • Direktmikroskopi, prestanda: Erfarenheten visar att 75-90 % odlingspositiva likvorprov ocksĂ„ Ă€r positiva i gramfĂ€rgning. Andelen minskar till 40-60 % hos patienter som fĂ„tt antibiotika innan lumbalpunktion. GramfĂ€rgning Ă€r mest tillförlitlig vid koncentrationer >=10^5 bakterier per mL kroppsvĂ€tska. Vid ett kraftigt inflammatoriskt svar (dvs mycket polymorfonukleĂ€ra leukocyter, PMNL, och hög proteinkoncentration) kan det emellertid vara svĂ„rt att urskilja bakterierna. AkridinorangefĂ€rgning underlĂ€ttar pĂ„tagligt bedömningen dĂ„ mycket leukocyter och hög proteinhalt föreligger.

Vid klassisk meningokockmeningit ses typiska gramnegativa diplokocker sÄvÀl extra- som intracellulÀrt i PMNL.

Pneumokocker framtrÀder vanligen som tydliga grampositiva diplokocker mot den mer eller mindre starkt rödfÀrgade bakgrunden av leukocyter, denaturerat protein och annat debris. I likvorprov skönjer man ofta nÀrvaro av kapsel som en uppklarning/Àndrad brytning till den gramfÀrgade cellvÀggen.

Grupp B streptokocker (GBS) ses i typiska fall som grampositiva kocker i kedjor.

H. influenzae ses som smala och korta gramnegativa stavar men kan variera i lÀngd sÄ att lÄnga filamentösa former ses. Bakterier i delning Àr nÄgot avsmalnande pÄ mitten. Detta gör att en ovan bedömare av ett dÄligt avfÀrgat grampreparat kan misstolka bilden som en grampositiv kock i diploform, ej helt olik en pneumokock. Vid ordentlig avfÀrgning kan de smala, korta stavarna vara svÄra att skilja frÄn andra rödfÀrgade strukturer i Àggviterika/cellrika likvorprov.

Listeria monocytogenes pÄvisas endast undantagsvis i gramfÀrgade likvorprov. Orsaken Àr den lÄga koncentrationen av bakterier i likvor. Trots namnet (monocytogenes) brukar inte likvor domineras av monocytÀra leukocyter utan har en övervikt av PMNL, som vid andra akuta bakteriella meningiter.

Observera att falskt negativ mikroskopi inte Àr ovanlig (10-25%), och att preliminÀra resultat kan vara falskt positiva om fÀrgning/mikroskopi/bedömning ej Àr optimal. FÀrska likvorprov ger en pÄtagligt tydligare mikroskopisk bild jÀmfört med Àldre prov. I purulent likvor sker vanligen ett sönderfall av leukocyter och, troligen bl a till följd av detta, en pÄverkan pÄ bakterierna som blir mindre viabla och sÀmre fÀrgbara. Det kan dÀrför vara klokt att vid akut omhÀndertagande av ett likvorprov göra nÄgra extra objektglas som vid behov senare kan anvÀndas för kompletterande fÀrgningar, t ex IF.

PrimÀrisolering

CNStabell8.jpg

Vid utodling frĂ„n likvor pĂ„ plattor anvĂ€nds minst 10 ÎŒL (blĂ„ ögla eller droppe) av ocentrifugerad grumlig likvor eller bottensats. Resterande volym fördelas pĂ„ flaskor. Det kan dock vara klokt att spara nĂ„got i kyl för ev kompletterande diagnostik vid negativ odling. Vid odling frĂ„n katetrar som legat inne under lĂ„ng tid eller shuntar frĂ„n CNS kan odlingens kĂ€nslighet ökas genom skakning i buljong eller genom att en nĂ„l/ledare passeras genom kanalen sĂ„ att ev biofilmer lösgörs. Fatta katetern med en pincett och för ner materialet i buljong tillsammans med katetern.

Övrig bakteriediagnostik

Antigendetektion

Under senare Är har vÀrdet av generell antigendetektion pÄ samtliga likvorprov som sÀnts till kliniskt diagnostiska laboratorier ifrÄgasatts. AnvÀndning av speciesspecifik diagnostik Àr emellertid indicerad vid misstÀnkta eller klara bakteriefynd vid direkt mikroskopi, eller eljest dÄ misstanken pÄ bakteriell meningit Àr stor.

Snabbdiagnostik genom antigenpÄvisning i likvor introducerades pÄ 1970-talet varefter följande metoder kommit till anvÀndning: motströmselektrofores (dE), latex- och co-agglutinationstest samt ELISA. CIE har 10 gÄnger lÀgre detektionsgrÀns Àn agglutination. Kommersiella agglutinationsreagens finns tillgÀngliga för Neisseria meningitidis (A, B, C, Y och W- 135), Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae typ b samt grupp B streptokocker (GBS). Antigen förekommer ocksÄ i blod och urin, dock i lÀgre koncentration. Urin bör koncentreras 20-50 gÄnger t ex genom ultrafiltrering före undersökning med agglutinationstest.

DetektionsgrĂ€nsen brukar anges till koncentrationer kring 10^4- 10^5 bakterier/mL. Den diagnostiska sensitiviteten varierar vĂ€sentligt i olika material och beroende pĂ„ bakterieslag, och Ă€r i bĂ€sta fall 80-90 %, dvs densamma som för optimal mikroskopi. Antigen kan pĂ„visas 1-10 dagar efter det att antibiotikaterapi satts in. Falskt positiva reaktioner kan orsakas av rheumatoid faktor, blod, hemolyserade röda blodkroppar liksom av höga proteinkoncentrationer. Kokning 5-15 min Ă€r ett vanligt sĂ€tt att reducera risken för ospecifika reaktioner.


CNSfigur13.jpg

OmhÀndertagande vid virologiskt laboratorium och svarstid

NÀr provet anlÀnder till laboratoriet omhÀndertas det enligt de faststÀllda procedurer, som för respektive undersökning finns angivna vid laboratoriet. NÄgot generellt test för att faststÀlla virusinfektion finns inte, utan undersökningarna mÄste anpassas till aktuell klinisk frÄgestÀllning. Minsta analystid för serologisk undersökning och DNA-PCR Àr 4-8 timmar. RNA-PCR tar minst tvÄ dygn. Virusisolering kan ge positivt resultat inom ett par dygn, men tar ofta minst en vecka. Negativa svar lÀmnas tidigast efter 1 vecka.

REFERENSER

  • Gray LD, Fedorko DP. Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. J Clin Microbiol Rev. 1992;5: 130-145.
  • Lindquist L, LinnĂ© T, Hansson LO, Kahn M, Axelsson G. Value of cerebrospinal fluid analysis in the differential diagnosis of meningitis: A study in 710 patients with suspected central nervous system infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988;7:374-380.
  • Thomas JG. Routine CSF antigen detection for agents associated with bacterial meningitis: another point of view. Clin Microbiol New Lett 1994;16:89-95.