CNS-infektioner-primär diagnostik

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Primär diagnostik

Omhändertagande av likvor på laboratoriet

Detta avsnitt omfattar centrifugering, mikrobiologisk och kemisk snabbanalys samt inokulering för primärisolering. (Se också Fig 13.)

Centrifugering

• Klar likvor: Vid låga bakterietal ökar sannolikheten att påvisa bakterier om materialet koncentreras. Vid meningit kan bakteriekoncentrationen vara så låg som 10 CFU/mL. När mer än 0,5 mL likvor finns tillgängligt kan materialet därför centrifugeras minst 15 min vid 1500-2500 x g. Bottensatsen används för inokulering av plattor och direkt mikroskopi, alternativt sugs supernatet först av (lämna ca 0,5 mL) och överförs till ett sterilt rör. Sedimentet blandas väl med Vortex eller pipett.

Koncentrering genom direktcentrifugering på objektglas (cytospin) ökar chansen att observera bakterier 100-faldigt jämfört med ocentrifugerad eller konventionellt centrifugerad likvor (1000 x g, 15 min).

• Grumlig likvor: Vid höga bakterietal kan färgning av ocentrifugerad likvor vara att föredra då den rika cellförekomsten annars kan skymma bakterierna.

Direktmikroskopi

Bottensats eller likvor appliceras på 2-3 rena objektglas. Glasen lufttorkas. Fixering med metanol bevarar leukocyterna bäst. Försiktig värmefixering över gaslåga går också bra.

• A) Gramfärgning: Bakterier färgas grampositivt eller gramnegativt beroende på skillnader i mängden peptidoglykan. Grampositiva arter har ett tjockt peptidoglykanskikt och relativt stora mängder teikonsyra. Peptidoglykanet komplementbinderjod och kristallviolett vilket förhindrar avfärgning med alkohol. Grampositiva bakterier behåller därför den blåvioletta ursprungsfärgen, om deras cellvägg inte är skadad genom ålder, antibiotika eller andra faktorer. Cellväggen hos gramnegativa arter har ett tunt peptidoglykanlager fäst på LPS. Det yttre membranet skadas av alkoholen och tillåter kristallviolett-jodkomplexet att läcka ut och ersättas av kontrastfärgen karbolfuchins röda färg. För teknisk beskrivning se Bilaga 1.

• B) Akridinorangefärgning: Akridinorange är en fluorokrom som tas upp av nukleinsyra. Bakterierna framträder med en orange färg vid lågt pH (4,0) mot en bakgrund av humana cellkärnor och vävnadsfragment som har en gulorange färg. Detektionsgränsen anges till $10^4$ CFU/mL. Avläsning kan ske vid 400x förstoring. Ett akridinorangefärgat preparat kan användas för gramfärgning utan föregående avfärgning.

• C) Direkt immunfluorescens (IF): Konjugat finns för pneumokocker, meningokocker, Haemophilus influenzae och grupp B streptokocker (GBS). För teknisk beskrivning se Bilaga 3 (CNS) och speciell del.

• Direktmikroskopi, prestanda: Erfarenheten visar att 75-90 % odlingspositiva likvorprov också är positiva i gramfärgning. Andelen minskar till 40-60 % hos patienter som fått antibiotika innan lumbalpunktion. Gramfärgning är mest tillförlitlig vid koncentrationer >=$10^5$ bakterier per mL kroppsvätska. Vid ett kraftigt inflammatoriskt svar (dvs mycket polymorfonukleära leukocyter, PMNL, och hög proteinkoncentration) kan det emellertid vara svårt att urskilja bakterierna. Akridinorangefärgning underlättar påtagligt bedömningen då mycket leukocyter och hög proteinhalt föreligger.

Vid klassisk meningokockmeningit ses typiska gramnegativa diplokocker såväl extra- som intracellulärt i PMNL.

Pneumokocker framträder vanligen som tydliga grampositiva diplokocker mot den mer eller mindre starkt rödfärgade bakgrunden av leukocyter, denaturerat protein och annat debris. I likvorprov skönjer man ofta närvaro av kapsel som en uppklarning/ändrad brytning till den gramfärgade cellväggen.

Grupp B streptokocker (GBS) ses i typiska fall som grampositiva kocker i kedjor.

H. influenzae ses som smala och korta gramnegativa stavar men kan variera i längd så att långa filamentösa former ses. Bakterier i delning är något avsmalnande på mitten. Detta gör att en ovan bedömare av ett dåligt avfärgat grampreparat kan misstolka bilden som en grampositiv kock i diploform, ej helt olik en pneumokock. Vid ordentlig avfärgning kan de smala, korta stavarna vara svåra att skilja från andra rödfärgade strukturer i äggviterika/cellrika likvorprov.

Listeria monocytogenes påvisas endast undantagsvis i gramfärgade likvorprov. Orsaken är den låga koncentrationen av bakterier i likvor. Trots namnet (monocytogenes) brukar inte likvor domineras av monocytära leukocyter utan har en övervikt av PMNL, som vid andra akuta bakteriella meningiter.

Observera att falskt negativ mikroskopi inte är ovanlig (10-25%), och att preliminära resultat kan vara falskt positiva om färgning/mikroskopi/bedömning ej är optimal. Färska likvorprov ger en påtagligt tydligare mikroskopisk bild jämfört med äldre prov. I purulent likvor sker vanligen ett sönderfall av leukocyter och, troligen bl a till följd av detta, en påverkan på bakterierna som blir mindre viabla och sämre färgbara. Det kan därför vara klokt att vid akut omhändertagande av ett likvorprov göra några extra objektglas som vid behov senare kan användas för kompletterande färgningar, t ex IF.

Primärisolering

Vid utodling från likvor på plattor används minst 10 μL (blå ögla eller droppe) av ocentrifugerad grumlig likvor eller bottensats. Resterande volym fördelas på flaskor. Det kan dock vara klokt att spara något i kyl för ev kompletterande diagnostik vid negativ odling. Vid odling från katetrar som legat inne under lång tid eller shuntar från CNS kan odlingens känslighet ökas genom skakning i buljong eller genom att en nål/ledare passeras genom kanalen så att ev biofilmer lösgörs. Fatta katetern med en pincett och för ner materialet i buljong tillsammans med katetern.

Övrig bakteriediagnostik

Antigendetektion

Under senare år har värdet av generell antigendetektion på samtliga likvorprov som sänts till kliniskt diagnostiska laboratorier ifrågasatts. Användning av speciesspecifik diagnostik är emellertid indicerad vid misstänkta eller klara bakteriefynd vid direkt mikroskopi, eller eljest då misstanken på bakteriell meningit är stor.

Snabbdiagnostik genom antigenpåvisning i likvor introducerades på 1970-talet varefter följande metoder kommit till användning: motströmselektrofores (dE), latex- och co-agglutinationstest samt ELISA. CIE har 10 gånger lägre detektionsgräns än agglutination. Kommersiella agglutinationsreagens finns tillgängliga för Neisseria meningitidis (A, B, C, Y och W- 135), Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae typ b samt grupp B streptokocker (GBS). Antigen förekommer också i blod och urin, dock i lägre koncentration. Urin bör koncentreras 20-50 gånger t ex genom ultrafiltrering före undersökning med agglutinationstest.

Detektionsgränsen brukar anges till koncentrationer kring $10^4$- $10^5$ bakterier/mL. Den diagnostiska sensitiviteten varierar väsentligt i olika material och beroende på bakterieslag, och är i bästa fall 80-90 %, dvs densamma som för optimal mikroskopi. Antigen kan påvisas 1-10 dagar efter det att antibiotikaterapi satts in. Falskt positiva reaktioner kan orsakas av rheumatoid faktor, blod, hemolyserade röda blodkroppar liksom av höga proteinkoncentrationer. Kokning 5-15 min är ett vanligt sätt att reducera risken för ospecifika reaktioner.

Omhändertagande vid virologiskt laboratorium och svarstid

När provet anländer till laboratoriet omhändertas det enligt de fastställda procedurer, som för respektive undersökning finns angivna vid laboratoriet. Något generellt test för att fastställa virusinfektion finns inte, utan undersökningarna måste anpassas till aktuell klinisk frågeställning. Minsta analystid för serologisk undersökning och DNA-PCR är 4-8 timmar. RNA-PCR tar minst två dygn. Virusisolering kan ge positivt resultat inom ett par dygn, men tar ofta minst en vecka. Negativa svar lämnas tidigast efter 1 vecka.

REFERENSER

• Gray LD, Fedorko DP. Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. J Clin Microbiol Rev. 1992;5: 130-145.

• Lindquist L, Linné T, Hansson LO, Kahn M, Axelsson G. Value of cerebrospinal fluid analysis in the differential diagnosis of meningitis: A study in 710 patients with suspected central nervous system infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988;7:374-380.

• Thomas JG. Routine CSF antigen detection for agents associated with bacterial meningitis: another point of view. Clin Microbiol New Lett 1994;16:89-95.