Campylobacter-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Campylobacter



Laboratoriediagnostik av Campylobacter species

AllmÀnt

Eftersom Campylobacter vÀxer lÄngsammare Àn annan tarmflora krÀvs selektiva medier innehÄllande antibiotika.

De Campylobacter-arter som Ă€r vanligast hos mĂ€nniska vĂ€xer bĂ€st vid 42 °C i mikroaerofil miljö bestĂ„ende av 3 %-15 % O2 och 1-10 % CO2. Inga otvetydigt kostnadseffektiva anrikningsförfaranden har beskrivits.

Vissa species som C. upsaliensis Ă€r kĂ€nsliga för antibiotika som ingĂ„r i de selektiva medierna. För isolering av sĂ„dana förordas filtreringsmetodik. Campylobacter passerar genom filter med porstorlek 0,45-0,65 ÎŒm, till skillnad frĂ„n de flesta andra tarmbakterier.

Beskriven referensmetodik inriktas i första hand pÄ diagnostik av C. jejuni/coli som Àr vanligast i Sverige.

Som ett komplement beskrivs ocksÄ referensmetodik för andra species som framkallar diarré hos mÀnniska.


Campylobacter jejuni/coli

Referensmetodik

Referenssubstrat

Blodfri selektiv campylobacteragar Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat. Substratets selektivitet beror pÄ tillsats av antibiotika (cefoperazone 32 mg/L, amfotericin B 10 mg/L) och deoxycholat vilka hÀmmar de flesta grampositiva bakterier och Àven de flesta av tarmens gramnegativa bakterier. En tillsats av kristallviolett hÀmmar grampositiva bakterier och jÀst. Substratet har validerats mot blodhaltig campylobacteragar och befunnits ge likvÀrdiga resultat till ett lÀgre pris. Andra antibiotikakombinationer innehÄllande cefalotin kan hÀmma Campylobacter och bör dÀrför undvikas.Ursprungligt substrat enl. Skirrow beskrivs i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat.

Isolering av Campylobacter jejuni/coli

Provmaterial stryks ut pĂ„ campylobacteragar och sekundĂ€rstryk görs med steril ögla. Inkubera plattan mikroaerofilt 42 °C i 2 dygn (optimal vĂ€xt i en atmosfĂ€r som innehĂ„ller 7 % O2 d.v.s. ca 1/3 av normal syrespĂ€nning och 10 % CO2, resten N2). LĂ€mplig atmosfĂ€r kan uppnĂ„s genom att evakuera en anaerobklocka utan katalysator till 1/3 och ersĂ€tta med en koldioxid-kvĂ€vgas blandning eller med hjĂ€lp av kommersiella gasgenererande kits. En studie utförd vid lasarettet i Falun gav vid handen att fler Campylobacter isolerades med Anoxomatutrustning Ă€n med klockor och Campy Pak.

AvlÀsning sker efter 1 och 2 dygn.

MisstÀnkta kolonier Àr vanligen genomskinliga, grÄ till metallglÀnsande; ibland med ett karakteristiskt utflytande/svÀrmande vÀxtsÀtt och ibland smÄ och toppiga. I de fall enskilda kolonier bildats har de ojÀmna och utflytande kanter.

Andra Campylobacter species

Referensmetodik

Referenssubstrat

Blodfri campylobacteragar utan antibiotika.


Isolering

  • C. upsaliensis vĂ€xer bra vid 42 °C men hĂ€mmas av antibiotika.
  • C. fetus vĂ€xer dĂ„ligt vid 42 °C. Vid sĂ€rskild misstanke odlas provet vid 37 °C.
  • C. hyointestinalis Ă€r beroende av H2 för vĂ€xt.
  • C. lari förvĂ€ntas vĂ€xa under samma betingelser som C. jejuni/coli.

Vid filtrering rekommenderas cellulosaacetat-membranfilter med 0,65 ÎŒm por-storlek. Filtret placeras pĂ„ antibiotikafritt medium. 10-15 droppar fecessuspension placeras pĂ„ filtret och plattan inkuberas i 37 °C en timme, varefter filtret tas bort och plattan reinkuberas i mikroaerofil miljö innehĂ„llande 7 % O2, 10 % CO2 och 6 % vĂ€tgas balanserat med N2 i 37 °C.

AvlÀs efter 1 och 2 dygn

Identifiering och minimikriterier

SÀkrast skiljs species Ät med molekylÀrgenetisk metodik. Verifiering av genus Campylobacter kan göras med anvÀndning av flaA genen i PCR. För identifiering till speciesnivÄ utnyttjas 16S rRNA analys [Fig. 13].


Fecesfigur13.jpg

Övrig diagnostik

MisstÀnkta kolonier verifieras rutinmÀssigt oftast genom mikroskopi, omspridning med och utan mikroaerofil miljö samt biokemiska test. Ofta utlÀmnas omspridning vid typiska fynd.


Mikroskopering

Campylobacter Ă€r gramnegativa, lĂ€tt böjda stavar med ”mĂ„svingeutseende”. Stundtals kan de upptrĂ€da som kockoida eller korta stavar.

Vid omodling pÄ selektiv campylobacteragar i mikroaerofil miljö 42 °C resp. aerob miljö 42 °C förvÀntas Campylobacter vÀxa endast pÄ plattan som inkuberats i mikroaerofil miljö.

Campylobacter Àr typiskt lÄngsamt oxidaspositiva och katalaspositiva.

Med dessa kriterier uppfyllda kan isolat frÄn mÀnniska anses identifierat som C. jejuni/coli. Den förenklade metodiken skall valideras mot referensmetoden.

Det bör dock framhÄllas att C. lari i stort pÄminner om C. jejuni och C. coli och att ovan beskrivet protokoll inte utesluter C. lari speciellt vid negativt hippurattest.

Campylobacter jejuni och coli kan skiljas Ät med hippurattest (positiv resp. negativ reaktion). Hippuratnegativa varianter av C. jejuni finns beskrivna men inga andra species Àn C. jejuni Àr hippuratpositiva varför specificiteten Àr hög. Hydrolys av natriumhippurat kan pÄvisas i rörtest ( ASM Manual of Clinical Microbiology 7th ed. p. 1668) eller med disk och tjockt inokulat. PÄvisande av hipO (hippuricas) genen med PCR kan ocksÄ anvÀndas.


Direktmikroskopi

Tack vare typisk morfologi kan Campylobacter identifieras i mikroskop pÄ fecesmaterial frÄn patienter med akut enterit. Förfarandet kan anvÀndas i utvalda fall dÀr infektion med andra species Àn Campylobacter jejuni/coli misstÀnks.

Nukleinsyradetektion

För direkt diagnostik av Campylobacter i feces med PCR saknas för nÀrvarande tillrÀcklig erfarenhet, men skulle teoretiskt kunna underlÀtta pÄvisandet av andra arter av Campylobacter Àn C. jejuni/coli.

Kommersiella metoder finns ej tillgÀngliga.