Corynebacterium diphtheriae/C. ulcerans

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad april 2012.


Huvudartikel


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar


Till förgreningssidan Corynebacterium diphtheriae för fler artiklar om bakterien


GramfÀrgat preparat av Corynebacterium diphtheriae. Bild CDC ID #7323 via Wikimedia Commons

Corynebacterium diphtheriae/C. ulcerans

SmittÀmnen

Difteri i smittskyddslagens mening Àr en sjukdom orsakad av exotoxinbildande Corynebacterium diphtheriae eller Corynebacterium ulcerans som Àr grampositiva difteroida stavar. Toxinet Àr ett vÀrmelabilt ADP-ribosyltransferas och bildas endast av stammar infekterade med fager som bÀr toxingenen. Difteribakterierna lokaliseras till slemhinnor vanligen i de övre luftvÀgarna, ibland i konjunktiva och urogenitalia. Lokala svalginfektioner kan upptrÀda Àven med icke toxinbildande stammar. Toxinnegativa stammar kan in vivo smittas av toxigena fager frÄn toxinbildande stam. Icke toxigena stammar av C. diphtheriae förekommer, frÀmst i kliniska prover frÄn individer som tidigare immuniserats mot difteritoxin. Toxinbildning förekommer Àven hos Corynebacterium ulcerans. SÄdana stammar kan ge en difteriliknande sjukdomsbild men nÄgra större epidemiska utbrott har dock inte beskrivits hos mÀnniska.

Även C. pseudotuberculosis kan vara toxinbildande och orsakar pseudotuberculos hos bland annat fĂ„r, getter, hĂ€star och nötkretur. Den Ă€r vanlig globalt sett, men ovanlig i Sverige. Den orsakar mycket sĂ€llan infektioner hos mĂ€nniska, Ă€ven om den möjligen Ă€r underdiagnosticerad.

Den klassiska indelningen i C. diphtheriae gravis, intermedius och mitis Äterspeglar inte en fallande klinisk svÄrighetsgrad. Eftersom jÀsningsmönstren för intermedius och mitis dessutom Àr identiska har dessa sammanförts som nongravis.

Patogenes och patofysiologi

Patogeniciteten Àr knuten till förmÄgan att bilda exotoxin. Toxinet adsorberas snabbt till cellmembranerna. Efter cellpenetration blockeras proteinsyntesen, vilket resulterar i irreversibel cellskada och celldöd. Affiniteten tycks vara störst till hjÀrta, njurar, och nervsystem. I slemhinnan utvecklas inom ett par dagar typiska membraner vilka kan sprida sig över stora omrÄden.

Symtom och klinisk bild

Efter en inkubationstid pÄ vanligen 2-5 dagar debuterar sjukdomen oftast som en faryngit som i vaccinerade populationer kan vara mycket lindrig. I mer uttalade fall tillstöter feber, ömmande halslymfkörtlar och membranbildning. Vid spridning till larynx, trakea och bronker kan obstruktion av luftvÀgarna uppstÄ (Àkta krupp). I svÄra fall ses kraftig toxisk pÄverkan och hjÀrtkomplikationer med myokardit, neurologiska komplikationer i form av polyneuriter samt tubulÀr njurskada med proteinuri.

Membranös konjunktivit Àr en ovanlig men allvarlig komplikation vid difteri som kan ge en keratit med svÄr Àrrbildning och blindhet.

Huddifteri Àr vanlig i tropiska och subtropiska klimat. Vid den primÀra formen ses pÄ extremiteterna rundade ofta multipla sÄr som tÀcks av en fast membran eller krusta som nÀr den lossnar blottlÀgger ett urstansat sÄr med dÄlig lÀkningsförmÄga. Organkomplikationer av samma typ som vid svalgdifteri förekommer men Àr ovanliga.

Epidemiologi

Fram till 1940-talet var difteri en vanlig och fruktad sjukdom med en morbiditet pĂ„ ca 5 % och en mortalitet kring 5-10 % av dessa. I mitten av 1990-talet pĂ„gick ett större utbrott i Ryssland pĂ„ grund av bristande vaccinering av vissa befolkningsgrupper. Den senaste difteriepidemin i Sverige intrĂ€ffade 1984-1986. Fram till 1988 anmĂ€ldes 38 kliniska fall varav 6 dödsfall. Sedan 1990-talet finns bara enstaka fall resistrearade. Ofta har toxinbildande korynebakterier isolerats frĂ„n sĂ„r dĂ€r smittan skett utomlands. År 2011 diagnostiserades svalgdifteri hos ett nyanlĂ€nt flyktingbarn i Sverige. Samtliga familjemedlemmar var ovaccinerade men vaccinerades omgĂ„ende och ingen insjuknade.

Prevention

Sedan vaccination med toxoid infördes i ett allmÀnt vaccinationsprogram pÄ 1950-talet har sjukdomen difteri sÄ gott som försvunnit hos fullvaccinerade. Enligt internationella rekommendationer har grÀnsen för immunitet lagts vid 0,1 IU/mL i seroepidemiologiska studier och partiell immunitet vid 0,01 IU.

Provtagning och transport

  • MisstĂ€nkt svalgdifteri: Provtagningspinnen rullas med kraft över membraner, vita belĂ€ggningar eller inflammerade omrĂ„den i svalget. Lyft helst eventuella membraner och försök fĂ„ med underliggande material.

Generellt rekommenderas ej ett ytterligare prov frÄn nasofarynx eftersom sammanstÀllningar frÄn senaste difteriepidemin i Sverige endast visar marginellt ökat utbyte med ett sÄdant förfarande. I det enskilda fallet kan nasofarynxprov fortfarande vara motiverat.

  • MisstĂ€nkt huddifteri och annan difteri (t ex konjunktiva, vulva): Rengör misstĂ€nkt sĂ„romrĂ„de med steril koksalt, avlĂ€gsna eventuella krustor och rulla provtagningspinnen med kraft i sĂ„ret. Vid klinisk misstanke om ögondifteri tas prov frĂ„n konjunktiva och/eller kornea samt nĂ€sa och svalg med bomullsarmerad provtagningspinne som nedförs i transportmedium.

Det Àr viktigt med upprepad provtagning.

Transport till laboratoriet sker i Amies agar gel medium. Provet bör vara laboratoriet tillhanda inom 24 tim. I vÀntan pÄ transport förvaras materialet i kylskÄp.

  • Remiss: Önskan om difteriodling mĂ„ste sĂ€rskilt anges pĂ„ remissen eftersom rutinmĂ€ssig odling av difteribakterier i allmĂ€nhet ej utförs. Vid misstanke om difteri bör dessutom laboratoriet varskos per telefon eftersom substraten mĂ„ste specialberedas.

Laboratoriediagnostik

Referensmetodik

PrimÀrisolering

  • Basmedia - Referensmedia (1) a) MTM (Modified Tinsdale’s Medium). (ÖLI-bilaga 5) b) Cystin/Tellurit blodagar (ÖLI-bilaga 5).
  • Utodling och inkubering: Utodling sker pĂ„ substrat i princip innehĂ„llande hĂ€stblod/serum, tellurit och cystin. SĂ„dana medier har god selektivitet. C. diphtheriae har förmĂ„ga att reducera cystin varvid bildas H2S som med tellurit ger en mörk telluriumförening. PĂ„ blodfri agar upptrĂ€der denna som en mörkbrun halo kring kolonierna.

Fosfomycinlappar (50 ÎŒg) kan ocksĂ„ anvĂ€ndas för selektion. Difteribakterier Ă€r generellt resistenta mot fosfomycin och vĂ€xer intill lappen.

Inkubering i 37 C aerobt helst med tillskott av 5 % CO2, 3 dygn. AvlĂ€sning sker efter 1, 2 och 3 dygn.

AvlÀsning, identifiering

  • Presumtiv diagnostik: PĂ„ tellurit blodagar Ă€r typiska kolonier grĂ„bruna till svarta. PĂ„ MTM-agar en mörkbrun halo runt misstĂ€nkta kolonier ses inom 2 dygn. SĂ„dana kan emellertid ocksĂ„ bildas av C. ulcerans, C. ovis, C. pseudotuberculosis och vissa streptokockstammar. C. diphtheriae Ă€r katalas- och vanligen nitratpositiv. Undantag utgör subtyp belfanti som inte reducerar nitrat (1).

Det Ă€r viktigt med positiva kontroller eftersom MTM-mediet kan vara av ojĂ€mn kvalitet. GramfĂ€rga misstĂ€nkta kolonier. Sök efter grampositiva eller gramlabila stavar i typisk ”pallisadformation” (se ocksĂ„ bild).

Slutlig verifiering

(För substratrecept se ÖLI-bilaga 6).

Slutlig verifiering sker med biokemiska kriterier (Tabell 1). Kommersiella kits kan ocksÄ anvÀndas.


Tabell 1. Biokemiska kriterier för diagnostik av vissa korynebakterier

Bakterie Glukos Sackaros Glykogen Urea Halo pÄ MTM
C. diphtheriae gravis + -^1 + - +
C. diphtheriae nongravis + -^1 - - +
C. ulcerans + - + + +
C. pseudotuberculosis + - - + +
C. xerosis + + - - -
C. pseudodiphtericum - - - + -

^1C. diphtheriae kan i sÀllsynta fall vara positiv i sackarostest


  • Toxinbildning: Alla isolat av C. diphtheriae och C. ulcerans skall undersökas med avseende pĂ„ toxinbildning. Den metod som vanligen anvĂ€nds Ă€r geldiffusion enligt Elek-Ouchterlony. Metodbeskrivning och tolkning av toxintest (se ÖLI-bilaga 15).

Flera PCR-metoder finns beskrivna och anvĂ€nds för pĂ„visning av toxin-genen. (Pallen, et al, 1994). Observera att en stam kan ha toxingenen utan att bilda toxin. Stammar av C. dihtheriae och C. ulcerans och sĂ„dana med osĂ€ker biokemi eller toxinbildning bör sĂ€ndas till referenslaboratorium för verifiering. Även enstaka isolat utan epidemiologisk bakgrund bör sĂ€ndas för verifiering. Eventuella isolat som identifieras som C. pseudotuberculosis skall ocksĂ„ verifieras avseende toxinbildning.

Indikationer för resistensbestÀmning

Isolerade difteribakterier Àr i allmÀnhet kÀnsliga för penicillin och erytromycin, varför resistensbestÀmning sÀllan blir aktuell.

Övriga metoder för pĂ„visande av difteribakterier

  • En PCR-baserad snabbmetod för diagnosen difteri finns beskriven frĂ„n CDC. HĂ€r anvĂ€ndes tvĂ„ primerset mot toxingenens subenheter för A och B.
  • Direktpreparat för mikroskopi Ă€r ofta svĂ„rbedömda Ă€ven med specialfĂ€rgningar. SĂ„vĂ€l falskt positiva som falskt negativa resultat Ă€r vanliga. Avsaknad av grampositiva stavar i ett direktpreparat kan dock ge viss klinisk vĂ€gledning.
  • Kommersiella testsystem för identifikation av korynebakterier finns tillgĂ€ngliga. Dessa bestĂ„r av en serie tester för fermentaion av olika substrat och biokemiska egenskaper (t ex. API Coryne system (Bio Merieux); Rapid ID,CB Plus system (RemelXXX)).
  • Maldi-Tof; mer omfattander erfarenheter saknas Ă€nnu men bakterierna finns medtagna i aktuella databaser som Ă€r kopplade till instrumenten.
  • AntikroppsbestĂ€mning: Metodik för bestĂ€mning av difteriantitoxin behandlas i annat sammanhang. AntikroppsbestĂ€mning anvĂ€nds sĂ€llan i diagnostiskt syfte.

Kvalitetskontroll

  • Referensstammar
    • Corynebacterium diphtheriae: CCUG 5863 (NCTC 3984), svagt tox +
    • Corynebacterium diphtheriae nongravis: CCUG 5865 (NCTC 10356), tox-
    • Corynebacterium diphtheriae gravis: CCUG 5864 (NCTC 10648), tox+
    • Corynebacterium ulcerans: CCUG 18646, tox+

Epidemiologisk typning

Tidigare anvÀnd fagtypning har nu ersatts av molekylÀr karakterisering. Under den senaste ryska epidemien pÄ 1990-talet utvecklades dels ribotypning dels MEE (multilocus enzyme electrophoresis). Ribotypning anses vara referensmetod och för att underlÀtta monitorering av cirkulerande kloner har en databas för ribotyper etablerats vid Institut Pasteur.(Grimont et al, 2004). Metoden finns inte uppsatt i Sverige.

En annan metod vars data Àr jÀmförbara mellan olika laboratorier Àr Multilocus sequencing (MLST). En allmÀn MLST-databas finns vid University of Oxford (http://pubmlst.org/cdiphtheriae/).

För lokala epidemiologiska frÄgestÀllningar kan Multi-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) anvÀndas. MLVA ger en högre upplösning vid jÀmförelse av olika stammar.

Svarsrutiner

Stam som visar biokemi typisk för C. diphtheriae och Àr toxinbildande i gel-diffusionstest enligt Elek-Ouchterlony svaras Corynebacterterium diphtheriae gravis/non-gravis, toxinbildande. Motsvarande stam som ej bildar toxin svaras Corynebacterium diphtheriae/ej toxinbildande. Enligt motsvarande kriterier svaras stam av C. ulcerans ut som Corynebacterium ulcerans / toxinbildande respektive Corynebacterium ulcerans / ej toxinbildande.

Eventuella fynd av C. pseudotuberculosis svaras ut enbart om de Àr toxinbildanade.


Laboratorierapportering

Toxinbildande C. diphtheriae, C. ulcerans och C. pseudotuberculosis Àr anmÀlningspliktiga enligt Smittskyddslagen.

Referensfunktioner

Ej beslutade

REFERENSER

  • Brooks R. Guidelines for the laboratory diagnosis of diphtheria. WHO Lab 81-7.
  • Golaz, A., Popovic, T., Wharton, M. Epidemiology of Diphtheria in the 1990s. Clin Microbiol Newslett. 2001;23:33-37.
  • Grimont PA, Grimont F, Efstratiou A, De Zoysa A, Mazurova I, Ruckly C, Lejay-Collin M, Martin-Delautre S, Regnault B; European Laboratory Working Group on Diphtheria. International nomenclature for Corynebacterium diphtheriae ribotypes. Res Microbiol. 2004;155: 162-6.
  • Mikhailovich, V., M., Melnikov, V., G., Mazurova, I., K., Wachsmuth, I., K., Wenger, J., D., Wharton, M.,Nakao, H., Popovic, T. Application of PCR for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheria epidemic. J Clin Microbiol. 1995;33:3061-3063.
  • Nakao, H., Popovic, T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. J Clin Microbiol. 1997;35:1651-1655.
  • Pallen MJ, Hay AJ, Puckey LH, Efstratiou A. Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin. J Clin Pathol. 1994; 47:353-6.
  • Grimont PA et al., and the European Laboratory Working Group on Diphtheria.International nomenclature for Corynebacterium diphtheriae ribotypes Res Microbiol. 2004 Apr;155(3):162-6.