Diagnostik vid nedre luftvÀgsinfektioner orsakade av bakterier

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Nedre luftvÀgsinfektioner, 2:a upplagan 2005


Diagnostik av nedre luftvÀgsinfektioner orsakade av bakterier


Odling

Odling karakteriseras dels som allmÀn dels som riktad. AllmÀn odling Àr referensmetod för pÄvisande av vanliga bakteriella patogener vid pneumoni, empyem och lungabscess. Stor hÀnsyn mÄste tas till patientens sjukdomsbild och immunstatus liksom till provtyp och transportförhÄllanden. Normalflora och kolonisation pÄverkar bedömningen. Kvantitativ odling kan öka specificiteten. Referensmetodik för allmÀn odling behandlas i ett sÀrskilt avsnitt.

Riktad odling varierar med misstÀnkt etiologiskt agens och behandlas dÀrför huvudsakligen under respektive organism.


Teknik baserad pÄ nukleinsyraamplifiering vid bakteriella infektioner

Polymerase chain reaction (PCR) Ă€r ett hjĂ€lpmedel som avsevĂ€rt bidragit till att underlĂ€tta pĂ„visandet av bakterier. Med tekniken utnyttjas naturens eget sĂ€tt att kopiera DNA och en för den sökta bakterien unik DNA-sekvens mĂ„ngfaldigas under förutsĂ€ttning att den finns i provet. Med s.k. primrar, syntetiskt tillverkade korta enkelstrĂ€ngade DNA-sekvenser, anges vilket DNA som skall kopieras. Genom ett cykliskt förfarande kan DNA frĂ„n en enda bakterie kopieras till ett antal av mellan 10^9 -10^1^2. Denna relativt stora mĂ€ngd nukleinsyra kan sedan pĂ„ olika sĂ€tt lĂ€tt detekteras vilket gör PCR-tekniken till en mycket kĂ€nslig metod. Även döda mikroorganismer kan identifieras.

Vid bakteriella nedre luftvÀgsinfektioner har PCR-tekniken fÄtt sin frÀmsta anvÀndning vid diagnostik av de svÄrodlade mikroorganismerna Mycoplasma pneumoniae och Chlamydophila pneumoniae. NÄgot som ocksÄ kan komplicera odlingsdiagnostiken av ovanstÄende bakterier Àr att kvantiteten av den sjukdomsframallande mikroorganismen ofta sjunker hos patienten nÄgra dagar efter insjuknandet bÄde som ett resultat av en naturlig process men ocksÄ pÄ grund av att mÄnga patienter antibiotikabehandlats en tid innan det aktuella provtagningstillfÀllet. I de hÀr fallen Àr ocksÄ PCR-teknikens höga kÀnslighet anvÀndbar.

PCR-tekniken har inneburit att provsvar kan lĂ€mnas, i de flesta fall redan dagen efter provets ankomst till laboratoriet, med bĂ„de hög specificitet och sensitivitet. Emellertid fĂ„r vi inte nĂ„gon kĂ€nnedom om bakteriens kĂ€nslighet för antimikrobiella medel. För att lösa denna typ av frĂ„gestĂ€llningar krĂ€vs fortfarande odling. Visserligen kan molekylĂ€rbiologiska tekniker, ofta inkluderande PCR, anvĂ€ndas för pĂ„visandet av resistens och resistensmekanismer. Men för bakterier involverade i NLI Ă€r det endast för pĂ„visandet av mecA-genen hos S. aureus som tekniken anvĂ€nds rutinmĂ€ssigt och inte frĂ€mst i forskningssyfte. Även typning av bakterier av betydelse för den epidemiologiska övervakningen sker numera oftast med molekylĂ€rbiologiska tekniker, huvudsakligen pĂ„ regionsjukhusen och fortfarande först efter föregĂ„ende renodling.

Realtids-PCR Àr en utveckling av konventionell PCR-teknik. Den kan anvÀndas kvantitativt med stöd av en standardkurva. Den kan ocksÄ anvÀndas kvalitativt och har dÄ fördelen över klassisk PCR av att resultaten genereras i realtid och inte krÀver separata arrangemang, sÄsom t.ex. agarosgel-elektrofores, för att detektera den amplifierade nukleinsyran. Resultaten Àr baserade pÄ hybridisering med specifik probe till den mÄngfaldigade nukleinsyran vilket innebÀr att tidsödande kompletterande tekniker, t.ex. southern blottning, för maximal sensitivitet och specificitet elimineras. Den sammantagna analystiden blir hÀrigenom ocksÄ kortare. Vid realtids-PCR kombineras mÄngfaldigandet av mÄl-DNA med detektion av produkten i samma reaktionsrör och risken för kontamination har dÀrmed minskat avsevÀrt.

Multiplex PCR innebÀr att flera olika nukleinsyrasekvenser kan detekteras vid en och samma reaktion. Detta kan synas anvÀndbart dÄ flera olika mikrobiella agens kan vara möjliga orsaker till patientens symtom. Det innebÀr dock tekniska svÄrigheter att designa primrar som inte stör varandra i reaktionen och det Àr sÀllan mer Àn 2-3 agens kan detekteras samtidigt.


16S och 23S rRNA

Den hÀr typen av nukleinsyrapÄvisning Àr baserad pÄ PCR med primrar som detekterar konserverade nukleinsyrasekvenser av de bakteriella kromosomala generna som kodar för 16S resp. 23S ribosomalt RNA (rRNA). Dessa sekvenser kan alltsÄ detekteras hos i det nÀrmaste alla bakterier. Den resulterande amplifierade nukleinsyran innehÄller ocksÄ variabla regioner som ger oss möjlighet att definiera species. 23S och i synnerhet 16S rRNA-generna kan alltsÄ i ett första skede anvÀndas för att detektera bakterier i allmÀnhet och genom efterföljande sekvensering och jÀmförelse av sekvensen med dem i databaser som t.ex. BLAST frÄn NCBI, kan en artbestÀmning fÄs. FörutsÀttning för metoden Àr att bakterien Àr i ren kultur.

Bakteriespecifik PCR och sekvensbestÀmning kan emellertid bara utföras pÄ en bakteriearts nukleinsyra i taget. DÄ prov frÄn NLI ocksÄ innehÄller bakterier frÄn den normala svalgfloran kan dessa prov inte analyseras avseende förekomst av den generella genen för t.ex. 16S rRNA utan att falskt positiva resultat erhÄlls. Tekniken anvÀnds endast i undantagsfall vid NLI och dÄ pÄ framodlade bakterier vars art inte kunnat identifieras exempelvis p.g.a. klen vÀxt.

Antigendetektion

Antigendetektion i urin har visat stor anvÀndbarhet för diagnostik av infektion orsakade av Legionella pneumophila serogrupp 1 och anges dÀr som referensmetod.

PÄvisande av pneumokockantigen vid pneumoni har ocksÄ visats kunna höja sensitiviteten vid diagnostik av pneumokockpneumoni.


Serologi

Infektionsserologi har varierande diagnostisk stÀllning beroende pÄ etiologiskt agens. Generellt ger serologin sen information eftersom acceptabel korrelation till infektionstillfÀllet krÀver akut- och konvalescentserum. Vid studier av exempelvis vaccineffektivitet Àr parad serologi nödvÀndigt komplement för att uppnÄ tillfredsstÀllande diagnostisk sensitivitet. Singelserumdiagnostik kan vara vilseledande dÄ förhöjda antikroppskoncentrationer kan ligga kvar över ett Är efter det aktuella infektionstillfÀllet.

Epidemiologisk typning

För det epidemiologiska arbetet vid t.ex. utbrottssituationer utnyttjas allt oftare det faktum att mikroorganismer med gemensamt, klonalt, ursprung har genetiskt identiska eller mycket lika nukleinsyra. Det finns dessutom en tillrÀckligt stor genetisk diversitet inom en bakterieart för att olika kloner ska kunna urskiljas bland stammar som samlats in frÄn t.ex. olika lokaler eller tidpunkter.

Utvecklingen av isolering, separation och mĂ„ngfaldigande av nukleinsyra under de senast Ă„rtiondena har lett till att ett flertal nukleinsyrabaserade subtypningsmetoder tagits fram. En av dessa Ă€r puls-fĂ€lt-gel-elektrofores (PFGE) utvecklad av Schwartz och Cantor 1984. PFGE har anvĂ€nts pĂ„ ett stort antal organismer och har dĂ„ visat sig ha hög diskriminerande förmĂ„ga och reproducerbarhet och visat sig vara jĂ€mförbar eller överlĂ€gsen andra tillgĂ€ngliga tekniker. Metoden ger genetisk information i form av ett karakteristiskt bandmönster av organsimens kromosomala DNA efter gelelektrofores. Ett restriktionsenzym anvĂ€nds som klyver bakteriens DNA till fragment som sedan separeras i storleksordning i agarosgel under speciella elektroforetiska förhĂ„llanden. DNA fragmenten Ă€r 20–750 kbp. DĂ„ fragment som Ă€r större Ă€n 40 kbp inte kan separeras effektivt i konventionell gelelektrofores anvĂ€nds utrustning som cykliskt alternerar orienteringen av det elektriska fĂ€ltet. PĂ„ det hĂ€r sĂ€ttet kan Ă€ven stora DNA-fragment, fĂ„s att förflytta sig i agarosgelen, med en hastighet som stĂ„r i proportion till fragmentens storlek.

Det Àr viktigt att DNA hÄlls intakt fram till det moment dÄ det klyvs med restriktionsenzym. En suspension av bakterier gjuts dÀrför in i agarospluggar innan bakterierna lyseras med hjÀlp av enzymer och detergenter. NÀr den stora kromosomala DNA-molekylen hÄlls pÄ plats av agarosen kan andra molekyler av cellrester tvÀttas bort. Klyvningen av DNA sker sedan med ett restriktionsenzym som valts efter sin förmÄga att kÀnna igen och klyva DNA sÄ att relativt fÄ (ca 15-20 stycken) men stora fragment erhÄlls. Agarospluggen som innehÄller den restriktionsenzymkluvna DNA-molekylen utsÀtts hÀrefter för PFGE. PÄ det sÀttet har varje bakterieklon ett unikt mönster av DNA-fragment som kan databehandlas och lagras i databaser för framtida jÀmförelser. Antalet gemensamma band hos olika bakterieisolat rÀknas. Förekomst av flera gemensamma band indikerar ett nÀrmare slÀktskap. Helt identiska bandmönster indikerar ett klonalt ursprung.

En nackdel hos metoden Àr att det visat sig vara svÄrt att definiera och namnge bandmönster. Den nÄgot bristfÀlliga nomenklaturen har försvÄrat kommunikationen mellan laboratorier rörande förekomst eller ej av olika bakteriekloner. Framtiden fÄr utvisa om PFGE kommer att kompletteras av andra metoder med högre kommunicerbarhet.


REFERENS

Schwartz D.C. and Cantor C.R. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient electrophoresis. Cell 37:67-75.