Diarréframkallande Escherichia coli-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Till huvudartikeln Diarréframkallande Escherichia coli


Laboratoriediagnostik av diarréframkallande Escherichia coli

AllmÀnt

DÄ selektiva medier för patogena E. coli saknas och andelen av den totala floran i ett fecesprov ofta Àr mycket lÄg stÀlls speciella krav pÄ diagnostiken, vilken bör innehÄlla tre steg: 1) screening med en kÀnslighet av en bakterie mot en bakgrund av minst 10^3 andra bakterier; 2) isolering och 3) verifiering. Ett alternativ till screening Àr att för varje prov testa minst 10 kolonier frÄn primÀrodlingen vilket dock medför en högre detektionsgrÀns. Diagnostik av patogena E. coli baseras lÀmpligast pÄ identifiering av virulensfaktorer eller andra egenskaper specifika för respektive kategori och ej med serologisk O-typning som tidigare var mycket vanlig. O-typning Àr att betrakta som en epidemiologisk metod men kan ibland komplettera övriga analysresultat som en klonal markör dÄ kunskap om ytterligare virulensegenskaper saknas. Dock kan O-antikroppar bundna till magnetiska kulor anvÀndas vid anriknings- och/eller isoleringssteg.

Undersökning av EAggEC Àr idag att betrakta som specialdiagnostik för FoU. DÀrför anges ingen referensmetod i detta avsnitt.


Referensmetodik

Referenssubstrat

  • MacConkey-agar (MAC, se kapitel 1.1.15), rekommenderas för primĂ€rodling av fecesprov. Om analysen omfattar samtliga diarrĂ©framkallande E. coli, inklusive EHEC rekommenderas i stĂ€llet anvĂ€ndning av sorbitol-MacConkey (SMAC, se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat), dock ej CT-SMAC.

PrimÀr utodling

Provet stryks pÄ MacConkey-agar (MAC) eller sorbitol-MacConkey (SMAC) agar. SekundÀr- och tertiÀrstryk görs med ögla. Plattan inkuberas över natt vid 36 °C - 38 °C och sparas dÀrefter i kyl. Vid mycket smÄ provmÀngder eller dÄlig vÀxt pÄ primÀrplatta odlas provet i BPV vid 42 °C i 24 tim. Detta material anvÀnds direkt för PCR-screening, respektive utodling pÄ MAC/SMAC.


PCR-screening

MĂ„lgener enligt tabell 17 pĂ„visas med PCR pĂ„ primĂ€rkultur eller enskilda kolonier. Metodbeskrivning ”DiarrĂ©framkallande Escherichia coli och shigatoxigena Enterobacteriaceae - pĂ„visning med PCR”, som tillĂ€mpas vid FolkhĂ€lsomyndigheten bifogas som exempel (Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarrĂ©framkallande E coli och EHEC).

Isolering frÄn PCR-positiva prov

Cirka 10 kolonier, med morfologi som E. coli, plockas och testas med PCR. Vid negativt resultat testas ett flertal pooler bestÄende av minst 10 kolonier vardera. Sammanlagt minst 100 kolonier bör ha testats innan isoleringsförsök avbryts. De ingÄende isolaten i positiva pooler testas sedan separat.


Identifiering och minimikriterier

PCR-positiva isolat karakteriseras med API 20E. Om biokemin Àr typisk för E. coli anses isolatet identifierat som ETEC (eltB/estA) eller EPEC (eae/bfpA). EPEC kan ocksÄ utgöras av eae-positiva, bfpA-negativa E. coli om dessa begrÀnsas till vissa serotyper (se tabell 18). Om ial-positivt isolat ej jÀser som Shigella, kan EIEC misstÀnkas.


Fecestabell17, 18.jpg



Alternativ diagnostik

Screening och/eller isolering kan utföras med ”kolonihybridisering” med eae-, ial-, eltB- eller estA-probe. DĂ„ anvĂ€nds radioaktiv DNA-probe (Se MĂ„lgen tabell 17) eller antikropp mot t.ex. toxin eller pili. Material slammas frĂ„n primĂ€rstryket i PBS, spĂ€ds och sprids pĂ„ MAC/SMAC med en tĂ€thet av 100-1000 CFU/platta.

Screening kan ocksĂ„ ske i bakteriesuspension med ELISA. OvanstĂ„ende metoder har dock högre detektionsgrĂ€ns Ă€n PCR men identifierar Ă„tminstone en klon av ETEC som ST-PCR missar. AnvĂ€ndning av ”kolonihybridisering” innebĂ€r ocksĂ„ att man vid positivt prov nĂ€stan alltid erhĂ„ller ett isolat. Isoleringssteget vid PCR-positiva prov kan underlĂ€ttas med IMS, som finns tillgĂ€ngligt för ett begrĂ€nsat antal EPEC/EHEC-serotyper frĂ„n Dynal Biotech.

  • Verifikationssteget kan utföras med en rad alternativa metoder
    • ETEC kan verifieras med DNA-probe GM1-gangliosid ELISA (LT), ELISA (ST) och Y1-adrenalcelltest (LT).
    • EPEC- och EAggEC-diagnostiken verifieras med DNA-probe alternativt av adhesionsmönstret pĂ„ Hep2- eller Hela-celler.
    • EIEC verifieras med SerĂ©ny test.


Epidemiologisk typning

FolkhÀlsomyndigheten utför vid utbrott epidemiologisk typning av tarmpatogena E. coli med PFGE och serotypning.

Kvalitetskontroll

Referensstammar se tabell 17.