Enterohemorragiska Escherichia coli-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Till huvudartikel Enterohemorragiska Escherichia coli (EHEC)



Laboratoriediagnostik

AllmÀnt

Sedan 980331 Àr STEC klassad som skyddsklass 3 (**) enl. AFS 1997:12, vilket innebÀr att sÀrkilt tillstÄnd frÄn Arbetsmiljöverket krÀvs för arbete med dessa organismer.

Diagnostiken hos mÀnniska Àr baserad pÄ att med PCR pÄvisa stx-genen i utodlade prover. PÄvisad stx1- och/eller stx2-gen utgör grunden för en EHEC-diagnos. FrÄn positiva prover görs försök att isolera stx-positiv bakterie för artbestÀmning. För rapportering enligt smittskyddslagen av EHEC O157 krÀvs faststÀllande av serogrupp. Om försök att isolera EHEC misslyckas kan laboratoriediagnosen baseras enbart pÄ PCR under förutsÀttning att detta förhÄllande uttrycks i svaret.

Det Àr angelÀget att stx-positiva non-O157 isolat skickas till FolkhÀlsomyndigheten för serotypning och analys av flera virulensgener. Resultaten kommer att utgöra ett underlag för framtida virulensassocierad definition av EHEC och dÀrmed sammanhÀngande revision av smittskyddslagen.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Se föregÄende avsnitt. Vid isolering/renspridning av EHEC O157:H7 kan CT-SMAC anvÀndas, se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat.

PrimÀr isolering

Provet stryks pÄ sorbitol-MacConkey agar (SMAC). SekundÀr- och tertiÀrstryk görs med ögla. Plattan inkuberas över natt vid 36 °C - 38 °C och avlÀses. Plattan sparas i kyl.

Vid mycket smÄ provmÀngder eller dÄlig vÀxt pÄ primÀrplatta odlas provet i buffrat peptonvatten (BPV) vid 42 °C i 24 tim (se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat). Detta material anvÀnds direkt för PCR-screening, resp. IMS (se nedan) och utodling pÄ SMAC.

PCR-screening

stx1, stx2 och eae pĂ„visas med PCR pĂ„ primĂ€rkultur eller enskilda kolonier. Metodbeskrivning ”DiarrĂ©framkallande Escherichia coli och shigatoxigena Enterobacteriaceae - pĂ„visning med PCR”, som tillĂ€mpas vid FolkhĂ€lsomyndigheten bifogas som exempel (Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarrĂ©framkallande E coli och EHEC).

Isolering av EHEC frÄn PCR-positiva prover

O157:H7 och O157:H: Försök att isolera E. coli O157:H7 görs genom att bleka (sorbitol-negativa) kolonier frÄn primÀrplatta plockas och testas med stx-PCR. Detta kan ocksÄ utföras direkt utan föregÄende PCR-screening. Om PCR Àr positiv renstryks för artidentifiering och agglutination mot O157-antisera.

Om inga bleka kolonier typiska för E. coli O157:H7 syns pÄ primÀrplattan kan omstrykning frÄn PCR-positivt primÀrstryk till sekundÀrplatta med SMAC göras.

Ytterligare försök att isolera E. coli O157:H7 kan utföras med immunomagnetisk separation (IMS). Del av PCR-positivt primÀrstryk eller motsvarande fecesprov preanrikas i BPV eller GN-buljong (se manual för Dynabeads anti O157) och eventuella E. coli O157 anrikas med Dynabeads anti-E. coli O157 magne-tiska kulor (Dynal Biotech, Norge) enligt tillverkarens instruktioner. Magnetiska kulor med adsorberade bakterier sprids pÄ SMAC. Efter inkubering syns ofta en blandflora pÄ plattan eftersom metoden ej Àr helt specifik. Om bleka kolonier typiska för E. coli O157:H7 Àr synliga, plockas och renstryks dessa pÄ SMAC för att dÀrefter testas med stx-PCR.

Parallellt med odling pÄ SMAC testas buljongkulturen och kulorna med stx-PCR. Del av buljongkulturen respektive kulorna inkuberas först vid 98 °C i 10 min och anvÀnds direkt som templat i PCR. Om starkare eller lika stark positiv signal erhÄlls pÄ kulorna som pÄ buljongkulturen har O157 sannolikt anrikats. Svagare eller ingen signal pÄ kulorna indikerar att provet sannolikt ej innehÄller O157.

Om E. coli O157:H7 ej kunnat isoleras trots indikation pÄ positiv IMS görs ytterligare ett anrikningsförsök men med de PCR-positiva kulorna som utgÄngspunkt. Anrikningen initieras Àven denna gÄng med odling i buljong. TvÄ konsekutiva anrikningar utförs ocksÄ pÄ prover med svag signal vid den primÀra PCR-screeningen eftersom dessa kan fÄ ett negativt PCR-resultat efter den första anrikningen.

O157:H- isoleras enklast genom anrikning med IMS och utodling pÄ SMAC. DÀrefter testas röda (sorbitol-positiva) kolonier pÄ sÀtt som anges nedan för non-O157.


Non-O157

Cirka 10 kolonier (med morfologi som E. coli) plockas och testas med PCR. Vid negativt resultat testas ett flertal pooler bestÄende av Ätminstone 10 kolonier vardera. De ingÄende kolonierna i positiva pooler testas sedan separat.

Som alternativ metod kan kolonihybridisering med stx-probe anvÀndas, varvid material frÄn primÀrstryket slammas i PBS, spÀds och sprids pÄ SMAC till en tÀthet av 100-1000 CFU/platta. Positiva kolonier renstryks pÄ SMAC och testas med stx-PCR.

Isolering med IMS, som finns tillgÀngligt för ett begrÀnsat antal EHEC-serotyper frÄn Dynal Biotech Àr ett alternativ.

Identifiering och minimikriterier

stx-positiva kolonier karakteriseras biokemiskt. Om resultatet Àr typiskt för E. coli anses isolatet identifierat som EHEC.

Även prov dĂ€r stx-genen pĂ„visats utan att enskild koloni identifierats kan besvaras positivt. Samtidig nĂ€rvaro av eae-genen förstĂ€rker fyndet.

Om misstanke pÄ EHEC O157:H7 finns utförs agglutinationstest i serogrupp specifikt antiserum (bilaga 2.2) pÄ bleka kolonier frÄn SMAC. Om sorbitol-negativt isolatet agglutinerar som O157 anses diagnosen EHEC O157 verifierad.

Isolat som ej agglutinerar i O157 skickas till FolkhĂ€lsomyndigheten för serotypning (O:H). FolkhĂ€lsomyndigheten utför ocksĂ„ analys av ett flertal virulensgener. Även O157 skickas till FolkhĂ€lsomyndigheten för pĂ„visande av H7-antigen med fliCH7-PCR och epidemiologisk typning med PFGE.

Alternativ diagnostik

ToxinpÄvisning

Kommersiella kits för pÄvisning av Shigatoxin finns tillgÀngliga. För nÀrvarande saknas erfarenhet av prestanda hos dessa jÀmfört med PCR pÄ ett större svenskt material.


Serologi

Serologi för pÄvisande av antikroppar mot EHEC-LPS har beskrivits i litteraturen och kan t.ex. anvÀndas för att komplettera ett stx-positivt PCR-resultat i avsaknad av isolat. FolkhÀlsomyndigheten vidarebefordrar prover till Public Health England för O157-serologi.

Epidemiologisk typning

FolkhÀlsomyndigheten utför epidemiologisk typning av EHEC med PFGE och serotypning.

Kvalitetskontroll

  • Referensstam
    • Escherichia coli ATCC 43887 eae (mĂ„lgen)
    • Escherichia coli ATCC 43889 stx2 (mĂ„lgen)
    • Escherichia coli ATCC 43890 stx1 (mĂ„lgen)