Genotypisk MRSA-verifiering

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad april 2012. InnehÄll preliminÀrt i vÀntan pÄ konsensusförfarande


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar

och

förgreningssidan MRSA


Genotypisk MRSA-verifiering exemplifierad med metod för LightCycler

Indikation

Verifiering av MRSA genom att pÄvisa mecA- och nuc-gen. Metoden Àr avsedd att anvÀndas för verifiering av misstÀnkta kolonier av MRSA pÄ agarplatta som identifierats i rutin-eller screeningprover. För presumptivt pÄvisande av MRSA i screeningprover hÀnvisas till artikel MRSA-screening enligt Halmstadmodellen.

Genen mecA kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sÀnkt affinitet för betalaktamantibiotika,vilket gör olika arter av mecA-bÀrande stafylokocker resistenta mot alla betalaktam-antibiotika inkluderande betalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. SÀrskilt allvarligt Àr meticillinresistens hos S. aureus, eftersom antibiotika ur denna grupp sedan lÀnge utgjort standardterapi vid infektioner med sÄdana bakterier.

Metoden som beskrivs hÀr Àr utformad för att pÄvisa förekomst av mecA-gen hos stafylokocker genom PCR-amplifiering av mÄlomrÄdet och detektion med SYBR Green med realtids-PCR-instrument. I kombination med pÄvisande av nuc-gen utförd med samma DNA-preparation Àr den avsedd för verifiering av fynd av MRSA. Primrar för mecA-amplifiering pÄvisar ocksÄ en variant av mecA-genen som pÄvisats bland annat i S. aureus-stammen LGA251 (1, 2)


Material

UtgÄngsmaterialet Àr renkultur pÄ blodagar av misstÀnkta bakterier. För amplifiering anvÀnds PCR-instrument LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) och reagenser LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics).

  • Referensstammar:
    • CCUG 35603 Staphylococcus aureus mecA+
    • CCUG 17621 Staphylococcus aureus mecA-
    • CCUG 63582 Staphylococcus aureus med mecALGA251
  • Primrar
    • PCR primer MEC9 5ÂŽ- TCACCAGGTTCAAC[Y]CAAAA (1)
    • PCR primer MEC10 5ÂŽ- CCTGAATC[W]GCTAATAATATTTC (1)
    • PCR primer NUC4 5’-TCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC (3)
    • PCR primer NUC5 5’-GAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCT TC (3)

Analys

DNA-frisÀttning

Slamma en liten koloni eller motsvarande mÀngd bakterier i 100 ”L sterilt avjoniserat vatten i ett sterilt 1.5 mL eppendorfrör. Se till att bakterierna blir ordentligt uppslammade.

MÀngden bakterier Àr lagom för analys nÀr man kan ana en lÀtt grumlighet.

PCR

Varje isolat analyseras i tvÄ separata 20 ”L PCR-reaktioner, en för detektion av nuc och en för mecA. PCR-reaktionerna innehÄller PCR-reagens enligt tillverkarens rekommendation, 0.5 ”M av respektive primrar (NUC4/NUC5 respektive MEC9/MEC10) och 2 ”L templat (suspension av bakterie).

Följande amplifieringsprofil anvÀnds:

MRSAPCR.jpg

Tolkning av resultatet

BestÀmning av smÀltpunkt (Tm) för PCR-produkter frÄn nuc respektive mecA amplifieringsprodukter Àr avgörande för tolkning av resultat. FörvÀntade Tm för mecA PCR-produkt Àr runt 78,6°C, för mecALGA251 runt 80.0°C och för nuc runt 79,2°C.

REFERENSER

  • 1. Laura GarcĂ­a-Álvarez et al. Meticillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark: a descriptive study. Lancet Infect Dis 2011;11: 595–603
  • 2 Shore AC et al. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Aug;55(8):3765-73. Epub 2011 Jun 2
  • 3 Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad. Egen design.