Identifiering-JĂ€st

Hoppa till: navigering, sök

Artikeln reviderad maj 2010


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner


Identifiering och minimikriterier, svamp


JĂ€st

JĂ€st Ă€r svampar som huvudsakligen förökar sig genom knoppning (blastokonidier). Till skillnad frĂ„n mögelsvampar, vilka identifieras genom makro- och mikroskopisk morfologi, identifieras de i allmĂ€nhet i laboratoriet genom en kombination av biokemiska och morfologiska egenskaper (se nedan Tabell 8). De flesta jĂ€starter vĂ€xer bra pĂ„ vanliga bakterie- och svampmedier (undantag Malassezia). VĂ€xt ses vanligen inom 1-3 dygn. De flesta jĂ€stisolat som pĂ„visats i laboratoriet tillhör slĂ€ktet Candida. I kliniska material i Sverige utgör C. albicans ofta ca 70 % av jĂ€stisolaten. Övriga Candida-arter stĂ„r för merparten av de resterande.

Övriga slĂ€kten som förekommer av och till Ă€r Cryptococcus, Saccharomyces, Pichia, Rhodotorula och Trichosporon. Geotrichum-arter tas ocksĂ„ med hĂ€r Ă€ven om dessa svampar förökar sig genom fragmentering av hyfer i artrokonidier. Deras kolonier liknar dock jĂ€st.

Eftersom C.albicans Àr vanligast och Àven lÀttidentifierad genom att den bildar karakteristiska groddslangar och klamydokonidier samt gröna kolonier pÄ CHROMagar Candida börjar jÀsttypning med att identifiera eller utesluta C. albicans. För att identifiera C. dubliniensis som ocksÄ bildar groddslangar, klamydokonidier och gröna kolonier behöver kompletterande tester (t.ex kommersiell latexagglutination) anvÀndas. Vid mukoida isolat samt vid klinisk kryptokockmisstanke görs tuschpreparat för att pÄvisa kapsel, som dock kan vara tunn eller saknas i kultur.


JĂ€stkarakteristika

NÀr en jÀstsvamp förlÀngs genom knoppning bildas en pseudohyf som saknar septa. Under vissa förhÄllanden, i synnerhet vid vÀxt i brist pÄ syrgas, kan vissa jÀstarter Àven bilda Àkta, septerade, hyfer. BÄde pseudohyfer och Àkta hyfer bildar mycel i substraten. C. albicans bildar i serum och vissa albuminhaltiga lösningar groddslangar, som upptrÀder som jÀmntjocka hyfliknande utskott frÄn blastokonidier, nÀr dessa inkuberas nÄgon timme vid 37 °C.

C. albicans kan Àven bilda klamydokonidier, vilka vanligen upptrÀder i Ànden av en pseudohyf som stora, sfÀriska, starkt refraktila celler. Generellt kan sÀgas, att de morfologiska kriterierna utgör utgÄngspunkten för slÀktetillhörighet, medan biokemiska kriterier i form av kolhydrat och nitratassimilation samt kolhydratjÀsning anvÀnds för att identifiera de enskilda arterna. Dock Àr ibland Àven den mikroskopiska vÀxten pÄ vissa medier karakteristisk för de enskilda arterna, i synnerhet gÀller detta Candida-slÀktet, men biokemiska tester Àr nödvÀndiga för att identifiera andra arter Àn C. albicans.

Karakteristika för slÀkten med medicinsk betydelse

har sammanfattats i nedanstÄende tabell.


Svamptabell8.jpg


Askomyceter

Candida: Candida Àr asexuella stadier (anamorf) av askomycet-jÀster representerande flera olika arter, slÀkten och familjer. Cellerna varierar i form och storlek. Förökningen sker vanligen genom multilateral knoppning. Pseudohyfer eller Àkta hyfer kan förekomma. C. glabrata glabrata karakteriseras av att regelbundet bilda smÄ sfÀriska celler men inga pseudohyfer eller hyfer (Tabell 10). Synlig pigmentering till följd av karotenoida pigment förekommer inte. Fermentation förekommer vanligen.

Saccharomyces: SlÀktet Saccharomyces assimilerar inte nitrat och bildar askosporer med jÀmn vÀgg. Fermentation förekommer och utnyttjas för bl.a. brödjÀsning (S.cerevisiae) samt öl-, vin- och annan etanoltillverkning.

Pichia (Hansenula) anomala: P. anomala assimilerar nitrat och bildar hattformade, halvsfÀriska eller saturnusformade askosporer.

Geotrichum: SlÀktet Geotrichum bildar inte blastokonidier och har bara hyfer, vilka fragmenteras i typiska rektangulÀra artrokonidier. Den vÀxer som platta pudriga kolonier och Àr anamorf. VÀxten Àr dÄlig vid 37 °C.

Basidiomyceter

SlÀktet Cryptococcus karakteriseras av kapselförsedda celler. Graden av kapselbildning beror pÄ odlingsmedium samt variationer mellan enskilda stammar. Alla arter Àr ureaspositiva och assimilerar inositol men fermenterar icke. Endast C. neoformans vÀxer vid 37 °C.

Den enda kÀnda patogena arterna Àr C. neoformans och C. gattii. De har ett sexuellt stadium, som tillhör slÀktet Filobasidiella inom basidiomyceterna. De sexuella formerna Àr Filobasidiella neoformans för C. neoformans och F. bacillispora för C. gattii. C. neoformans har tvÄ genotyper C. neoformans var. grubii (serotyp A) och C. neoformans var. neoformans (serotyp D). C. gattii har tvÄ serotyper: B och C (Bovers M, Hagen F, Boekhout T. 2008). Serotyperna A och D kan differentieras frÄn B och C med kanavaninagar (Bilaga 3).

Trichosporon: SlÀktet Trichosporon karakteriseras av att bilda artrokonidier utöver blastokonidier och hyfer. Detta ses lÀttast pÄ majsagar (Bilaga 3).

Rhodotorula: SlÀktet Rhodotorula karakteriseras av att spjÀlka urea och bilda röda eller gula karotenoida pigment samt att inte assimilera inositol. Rhodotorula saknar pseudomycel. Fermentation förekommer ej.

Typningsmetoder

Det finns tvÄ snabba test, som behöver utföras initialt, nÀr ett jÀstisolat först pÄvisas i laboratoriet. Icke mukoida kolonier prövas pÄ bildning av groddslang. Om detta Àr positivt Àr det frÄga om Candida albicans eller C. dubliniensis. Det mukoida isolatet prövas med tusch -om kapsel pÄvisas Àr det kryptokocker varvid kompletterande biokemiska tester behövs för artbestÀmning. Om groddslang inte bildas och kapsel inte finns mÄste man gÄ vidare med odlingstester inklusive biokemiska tester, som tar tvÄ till sju dygn för artbestÀmning.


Bildning av groddslangar

Bildning av groddslangar Ă€r en snabb identifieringsmetod för Candida albicans som kan utföras pĂ„ primĂ€risolat eller renkultur. Bildningen av groddslangar i serum eller likartade medier kan under optimala förhĂ„llanden pĂ„visas hos 95-97 % av kliniska isolat av Candida albicans. Falskt negativa resultat kan uppkomma om ursprungskulturen inte gĂ„tt in i stationĂ€rfas. Förutom C. albicans ger C. dubliniensis positiv groddslangtest. D. dubliniensis Ă€r ett species som ursprungligen isolerades frĂ„n HIV-patienter med oral candidos (Sullivan et al., 1995, Pinjon et al., 1998).

Testet utförs pÄ följande sÀtt:

  • 1. Placera 0,5 mL hĂ€st-, human- eller kalvserum (citratplasma gĂ„r ocksĂ„ bra) alternativt hönsalbumin i ett litet provrör. Tillsats av 0,5 -1 % glukos pĂ„skyndar groddslangbildning.
  • 2. Suspendera en liten del av en jĂ€stkoloni i mediet.
  • 3. Inkubera vid 37 °C i termostat 1,5- 3 timmar.
  • 4. Överför dĂ€refter en droppe frĂ„n odlingen till ett objektglas, lĂ€gg pĂ„ ett tĂ€ckglas och granska i mikroskop om groddslangar bildats. Groddslangar upptrĂ€der som cylindriska trĂ„dar, som utgĂ„r frĂ„n blastokonidien utan nĂ„gon insnörning vid utgĂ„ngspunkten och utan nĂ„gon pĂ„taglig expansion lĂ€ngs trĂ„den (Fig 4).


Svampfigur4.jpg


Kapselbildning

Om kolonin Àr mukoid eller om patientens sjukhistoria ger anledning till misstanke, bör man försöka pÄvisa kapsel, som Àr ett kÀnnetecken för kryptokocker (bilaga 2). Kapselantigen kan pÄvisas med latexagglutinationstest, som Àr specifik för C. neoformans.

Om kapsel pÄvisas utförs assimilationstest för att bestÀmma kryptokockart och Àven test för fenoloxidas (se Bilaga 3).

Bildning av pseudohyfer och klamydokonidier (Tabell 10)

Följande medier förekommer kommersiellt och Ă€r lĂ€mpliga för att fĂ„ fram bildning av pseudohyfer, hyfer och klamydokonidier: “corn meal”(majsmjöl)-agar med TWEEN 80 helst utan glukos (Bilaga 3), natriumtaurokolatagar (Bilaga 3), och potatisglukosagar (Bilaga 3).

Om denna typningsprocedur utförs sÀllan kan 15 mL substrat förvaras i provrör med skruvlock och smÀltas för att gjuta en agarplatta inför anvÀndningen. Om flera typningar utförs samma dag kan plattan delas i fyra till Ätta sektorer.

  • 1. Ta en liten del av en jĂ€stkoloni med en plastögla, platinaspets eller agarkniv (tillhamrad platinatrĂ„d) och dra parallella rispor i agarmediet för att provocera mycelbildning. Placera ett sterilt tĂ€ckglas över inokulatet.
  • 2. Inkubera vid 27-30 °C i upp till tre dagar.
  • 3. Efter 48 tim. odling kan plattan avlĂ€sas mikroskopiskt. Börja med lĂ„g förstoring, senare med 40x objektiv.


Candida-arter med undantag av Candida glabrata bildar vanligen rikligt med pseudohyfer, ibland Àkta mycel, som vÀxer ut i substratet frÄn kanten av inokulatet. Grupper av ovala till sfÀriska blastokonidier kan ofta iakttas lÀngs hyferna. Hyfernas och blastokonidiernas inbördes placering Àr ofta karakteristiska för den enskilda arten. Stora, starkt refraktila, tjockvÀggiga klamydokonidier kan iakttas i Ànden eller pÄ korta sidogrenar av hyfer hos C. albicans och C. dubliniensis.


Biokemiska tester och specialsubstrat (Tabell 9)


Kolhydratfermentationstester Àr diskriminerande sÀrskilt ihop med assimilationstester (se Tabell 10).

Referensmetodik

Fermentation

Princip

JĂ€stsvampens förmĂ„ga att jĂ€sa vissa sockerarter pĂ„visas med gasbildning. Gasen fĂ„ngas upp i smĂ„ upp-och-nervĂ€nda durhamrör i jĂ€sningsrören. Olika arter har skilda jĂ€sningsmönster, skillnad Ă€ven med avseende pĂ„ hur starkt och hur snabbt sockerarten fermenteras. Detta markeras i referensböckerna med “w” för weak och “d” för delayed efter aktuell sockerart för de olika svamparna.


Utförande

JÀstsvampen slammas i NaCl till en tÀthet av ca 1 McFarland, 1 droppe inokuleras till varje sockerjÀsningsrör (Bilaga 3), inkuberas vid 25-30 °C och studeras med 2-3 dagars mellanrum upp till 10 dagar, varvid omskakas för att notera ev. begynnande jÀsning. Denna ses som smÄ gasbubblor som stiger i röret. Om jÀsten anvÀnder sockret i röret aerobt vÀxer den i övre delen av röret och adapteras till sockret ifrÄga. Den adapterade jÀsten sjunker till botten dÀr syrekoncentrationen Àr lÄg. HÀr kan sockret metaboliseras anaerobt och CO2-bubblor stiger upp i det inverterade röret. JÀsningsförmÄgan mÀts genom att notera hur mycket gas som bildats, hur snabbt och frÄn vilka sockerarter. Rekommenderade socker Àr D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos, laktos, trehalos och raffinos.

Assimilation

Princip

BestÀmning av förmÄgan hos jÀstsvamp att anvÀnda en enda kolkÀlla (sockerart) vid aerob vÀxt. Assimilation betyder att svampen tar upp och bryter ner sockret ifrÄga. Denna förmÄga undersöks genom att tillsÀtta svampen till en kolhydratfri agar och dÀrefter tillföra sockerarter. VÀxt runt sockerarten visar att svampen har förmÄga att assimilera denna.


Utförande

JÀstsvampen slammas i NaCl till ca 2 McFarland. 0,5 mL av denna suspension hÀlls i en petriskÄl (9 cm diameter). TillsÀtt ca 10 mL smÀlt avsvalnad (40-42 °C) assimilationsagar (Bilaga 3). Blanda agarn och svampsuspensionen noga genom att snurra plattan med- och motsols. LÀgg de olika sockren (en knivsudd kristaller alt. sockerimpregnerade lappar) vid kanten pÄ plattan nÀr denna har stelnat. Fem olika sockerfÄr plats pÄ varje platta. Antalet sockerarter som testas kan variera. För att fÄ sÀker diagnostik bör dock minst 16 testas.

Följande rekommenderas: D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos, laktos, cellobios, trehalos, melibios, raffinos, melezitos, xylos, L-sorbos, erytritol, D-mannitol, D-glucitol (=D-sorbitol) och inositol. Assimilationsmönster (auxanogram) fÄs genom att notera vilka socker svampen kan utnyttja för tillvÀxt. Plattorna inkuberas 2 dygn i 25-30 °C. Assimilation ses som en vÀxtzon runt respektive sockerart. För tolkning av resultaten, se referenslitteraturen, t.ex. Barnett et al.

RAT-test (Rapid Assimilation of Trehalose) utförs för att snabbidentifiera Candida glabrata

Kolonier som testas skall ha smÄ rundovala blastokonidier och ej pseudomycel. Svampkolonierna bör vara 2-4 dagar gamla. Endagarskolonier blir ofta negativa.

  • 1) HĂ€ll 2-3 pasteurdroppar RAT-medium (Bilaga 3) till en mikrotiterplatta, en brunn per test.
  • 2) Slamma en full 1 ”L-ögla jĂ€stsvamp till brunnen. Tjockt inokulat Ă€r viktigt för testets sensitivitet.
  • 3) Inkubera plattan med lock i 37 °C 1-11/2 timme. Ta med C. glabrata (ATCC 90030) som positiv kontroll och C. albicans (ATCC 90028) som negativ kontroll vid varje testtillfĂ€lle.
  • 4) Vid posisiv test för C. glabrata Ă€ndrar mediet fĂ€rg frĂ„n blĂ„tt till gult/gulgrönt. Negativ test utesluter ej C. glabrata.


Nitratassimilation utförs antingen analogt med kolhydratsassimilation men med kvÀvefri agar eller anvÀnds MKA-rör som inokuleras med en jÀstkoloni och inkuberas vid 25-30 °C, 2 dygn. Vid positiv assimilation Àndras substratets fÀrg frÄn grön till blÄ (Bilaga 3).

Speciella tester för C. neoformans

Kryptokockkolonin Ă€r vitbeige, ofta slemmig p.g.a. kapseln. Äldre (1 vecka) kolonier blir bruna. Alla kryptokocker Ă€r icke-fermentativa aerober.

Fenoloxidasaktivitet, d.v.s. bildningen av melaninliknande pigment (orto-och parafenoler) anvÀnds för snabb preliminÀr identifiering av C. neoformans. MÄnga olika substrat kan anvÀndas för att pÄvisa melaninbildning, t.ex. dopamin och dihydroxyfenylalanin (DOPA).

FörmÄga att bilda bruna kolonier pÄ dessa substrat Àr tecken pÄ förekomst av fenoloxidas (Bilaga 3).

Agarplattor med DOPA-medium inokuleras med misstÀnkt koloni C. neoformans och inkuberas vid 20-30 °C i minst 3 dagar. C. neoformans framtrÀder som mörkbruna till svarta kolonier. Positiv och negativ kontroll odlas pÄ varje platta (bilaga 4).

Ureahydrolys: Ureasbildning Àr ett karakteristikum, som Àr anvÀndbart för att identifiera kryptokocker och flera andra basidiomycetjÀstarter. Alla Rhodotorula och de flesta Trichosporon-arter bildar ocksÄ ureas. Mediet Àr Christensens ureaagar (Bilaga 3) som Àven anvÀnds för bakterier. Ett rör med ureamedium inokuleras med en ögla jÀstmaterial. Det Àr lÀmpligt att lÀgga till en positiv och negativ kontroll (bilaga 4). Rören inkuberas vid 25-30 °C. En rosa fÀrg upptrÀder efter 2-5 dagar vid positiv reaktion p.g.a. alkaliskt pH genom ammoniakbildning.

Diagnostiska kits

Med den ökande kunskapen om att svampars genus- och speciestillhörighet ocksÄ ger relativt sÀker terapeutisk vÀgledning har ett stort antal produkter för typning av jÀstisolat utvecklats och saluförts. De bygger oftast pÄ assimilation eller identifiering av karakteristisk enzymbildning, den senare krÀver ibland induktion pÄ specifika medier. Stor följsamhet till producentens anvisningar om inokulat och inkuberingsförhÄllande krÀvs i allmÀnhet för goda resultat. Exempel pÄ kits Àr Vitek, ID32C och API20 Caux (alla frÄn BioMérieux). PÄ svenska mykologiska laboratorier har "in house" metoderna (jÀsning och assimilation) i huvudsak ersatts med Vitek eller ID32C kits. Resultaten bör, vid behov, verifieras med mikromorfologi och ev. andra metoder.

Kommersiella snabbtester

Det finns en kommersiell latex agglutinationstest, Bichro-Latex albicans, för gruppidentifiering av Candida albicans och Candida dubliniensis frÄn Fumouze Diagnostics. Denna test kan anvÀndas i stÀllet för serumtest (bildning av groddslangar) pÄ isolerade kolonier. Positiv agglutination tyder pÄ att stammen Àr antingen C. albicans eller C. dubliniensis. Fördelen med agglutination Àr att den tar bara 5 min att utföra.

För att sÀrskilja C. dubliniensis frÄn C. albicans kan en annan agglutinationstest, Bichro-Dubli (Fumouze Diagnostics) anvÀndas. Latexpartiklarna Àr tÀckta med monoklonala antikroppar mot C. dubliniensis ytantigen. Denna test Àr bÄde kÀnslig och specifik för artidentifiering av C. dubliniensis.

För artidentifiering av Candida krusei finns en latex agglutinationstest, Krusei-Color (Fumouze Diagnostics). Latexpartiklarna Àr tÀckta med monoklonala antikroppar som medger specifik identifiering av C. krusei.

För identifiering av Candida glabrata kan en snabb trehalostest, Glabrata R.T.T. (Fumouze Diagnostics) anvÀndas. Denna test bygger pÄ C. glabrata jÀstens förmÄga att kunna snabbt hydrolysera trehalos till glukos. Fördelen med denna test jÀmfört med in-house trehalostest (RAT-test) Àr att Glabrata R.T.T. testkortet innehÄller, förutom brunnen med trehalos, tvÄ kontrollbrunnar, en med maltos och en med enbart basmedium, för att öka testens specificitet.