Identifiering-Jäst

Artikeln reviderad maj 2010

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner

Identifiering och minimikriterier, svamp

Jäst[redigera]

Jäst är svampar som huvudsakligen förökar sig genom knoppning (blastokonidier). Till skillnad från mögelsvampar, vilka identifieras genom makro- och mikroskopisk morfologi, identifieras de i allmänhet i laboratoriet genom en kombination av biokemiska och morfologiska egenskaper (se nedan Tabell 8). De flesta jästarter växer bra på vanliga bakterie- och svampmedier (undantag Malassezia). Växt ses vanligen inom 1-3 dygn. De flesta jästisolat som påvisats i laboratoriet tillhör släktet Candida. I kliniska material i Sverige utgör C. albicans ofta ca 70 % av jästisolaten. Övriga Candida-arter står för merparten av de resterande.

Övriga släkten som förekommer av och till är Cryptococcus, Saccharomyces, Pichia, Rhodotorula och Trichosporon. Geotrichum-arter tas också med här även om dessa svampar förökar sig genom fragmentering av hyfer i artrokonidier. Deras kolonier liknar dock jäst.

Eftersom C.albicans är vanligast och även lättidentifierad genom att den bildar karakteristiska groddslangar och klamydokonidier samt gröna kolonier på CHROMagar Candida börjar jästtypning med att identifiera eller utesluta C. albicans. För att identifiera C. dubliniensis som också bildar groddslangar, klamydokonidier och gröna kolonier behöver kompletterande tester (t.ex kommersiell latexagglutination) användas. Vid mukoida isolat samt vid klinisk kryptokockmisstanke görs tuschpreparat för att påvisa kapsel, som dock kan vara tunn eller saknas i kultur.

Jästkarakteristika[redigera]

När en jästsvamp förlängs genom knoppning bildas en pseudohyf som saknar septa. Under vissa förhållanden, i synnerhet vid växt i brist på syrgas, kan vissa jästarter även bilda äkta, septerade, hyfer. Både pseudohyfer och äkta hyfer bildar mycel i substraten. C. albicans bildar i serum och vissa albuminhaltiga lösningar groddslangar, som uppträder som jämntjocka hyfliknande utskott från blastokonidier, när dessa inkuberas någon timme vid 37 °C.

C. albicans kan även bilda klamydokonidier, vilka vanligen uppträder i änden av en pseudohyf som stora, sfäriska, starkt refraktila celler. Generellt kan sägas, att de morfologiska kriterierna utgör utgångspunkten för släktetillhörighet, medan biokemiska kriterier i form av kolhydrat och nitratassimilation samt kolhydratjäsning används för att identifiera de enskilda arterna. Dock är ibland även den mikroskopiska växten på vissa medier karakteristisk för de enskilda arterna, i synnerhet gäller detta Candida-släktet, men biokemiska tester är nödvändiga för att identifiera andra arter än C. albicans.

Karakteristika för släkten med medicinsk betydelse[redigera]

har sammanfattats i nedanstående tabell.

Askomyceter[redigera]

Candida: Candida är asexuella stadier (anamorf) av askomycet-jäster representerande flera olika arter, släkten och familjer. Cellerna varierar i form och storlek. Förökningen sker vanligen genom multilateral knoppning. Pseudohyfer eller äkta hyfer kan förekomma. C. glabrata glabrata karakteriseras av att regelbundet bilda små sfäriska celler men inga pseudohyfer eller hyfer (Tabell 10). Synlig pigmentering till följd av karotenoida pigment förekommer inte. Fermentation förekommer vanligen.

Saccharomyces: Släktet Saccharomyces assimilerar inte nitrat och bildar askosporer med jämn vägg. Fermentation förekommer och utnyttjas för bl.a. brödjäsning (S.cerevisiae) samt öl-, vin- och annan etanoltillverkning.

Pichia (Hansenula) anomala: P. anomala assimilerar nitrat och bildar hattformade, halvsfäriska eller saturnusformade askosporer.

Geotrichum: Släktet Geotrichum bildar inte blastokonidier och har bara hyfer, vilka fragmenteras i typiska rektangulära artrokonidier. Den växer som platta pudriga kolonier och är anamorf. Växten är dålig vid 37 °C.

Basidiomyceter[redigera]

Släktet Cryptococcus karakteriseras av kapselförsedda celler. Graden av kapselbildning beror på odlingsmedium samt variationer mellan enskilda stammar. Alla arter är ureaspositiva och assimilerar inositol men fermenterar icke. Endast C. neoformans växer vid 37 °C.

Den enda kända patogena arterna är C. neoformans och C. gattii. De har ett sexuellt stadium, som tillhör släktet Filobasidiella inom basidiomyceterna. De sexuella formerna är Filobasidiella neoformans för C. neoformans och F. bacillispora för C. gattii. C. neoformans har två genotyper C. neoformans var. grubii (serotyp A) och C. neoformans var. neoformans (serotyp D). C. gattii har två serotyper: B och C (Bovers M, Hagen F, Boekhout T. 2008). Serotyperna A och D kan differentieras från B och C med kanavaninagar (Bilaga 3).

Trichosporon: Släktet Trichosporon karakteriseras av att bilda artrokonidier utöver blastokonidier och hyfer. Detta ses lättast på majsagar (Bilaga 3).

Rhodotorula: Släktet Rhodotorula karakteriseras av att spjälka urea och bilda röda eller gula karotenoida pigment samt att inte assimilera inositol. Rhodotorula saknar pseudomycel. Fermentation förekommer ej.

Typningsmetoder[redigera]

Det finns två snabba test, som behöver utföras initialt, när ett jästisolat först påvisas i laboratoriet. Icke mukoida kolonier prövas på bildning av groddslang. Om detta är positivt är det fråga om Candida albicans eller C. dubliniensis. Det mukoida isolatet prövas med tusch -om kapsel påvisas är det kryptokocker varvid kompletterande biokemiska tester behövs för artbestämning. Om groddslang inte bildas och kapsel inte finns måste man gå vidare med odlingstester inklusive biokemiska tester, som tar två till sju dygn för artbestämning.

Bildning av groddslangar[redigera]

Bildning av groddslangar är en snabb identifieringsmetod för Candida albicans som kan utföras på primärisolat eller renkultur. Bildningen av groddslangar i serum eller likartade medier kan under optimala förhållanden påvisas hos 95-97 % av kliniska isolat av Candida albicans. Falskt negativa resultat kan uppkomma om ursprungskulturen inte gått in i stationärfas. Förutom C. albicans ger C. dubliniensis positiv groddslangtest. D. dubliniensis är ett species som ursprungligen isolerades från HIV-patienter med oral candidos (Sullivan et al., 1995, Pinjon et al., 1998).

Testet utförs på följande sätt:

1. Placera 0,5 mL häst-, human- eller kalvserum (citratplasma går också bra) alternativt hönsalbumin i ett litet provrör. Tillsats av 0,5 -1 % glukos påskyndar groddslangbildning.
2. Suspendera en liten del av en jästkoloni i mediet.
3. Inkubera vid 37 °C i termostat 1,5- 3 timmar.
4. Överför därefter en droppe från odlingen till ett objektglas, lägg på ett täckglas och granska i mikroskop om groddslangar bildats. Groddslangar uppträder som cylindriska trådar, som utgår från blastokonidien utan någon insnörning vid utgångspunkten och utan någon påtaglig expansion längs tråden (Fig 4).

Kapselbildning[redigera]

Om kolonin är mukoid eller om patientens sjukhistoria ger anledning till misstanke, bör man försöka påvisa kapsel, som är ett kännetecken för kryptokocker (bilaga 2). Kapselantigen kan påvisas med latexagglutinationstest, som är specifik för C. neoformans.

Om kapsel påvisas utförs assimilationstest för att bestämma kryptokockart och även test för fenoloxidas (se Bilaga 3).

Bildning av pseudohyfer och klamydokonidier (Tabell 10)[redigera]

Följande medier förekommer kommersiellt och är lämpliga för att få fram bildning av pseudohyfer, hyfer och klamydokonidier: “corn meal”(majsmjöl)-agar med TWEEN 80 helst utan glukos (Bilaga 3), natriumtaurokolatagar (Bilaga 3), och potatisglukosagar (Bilaga 3).

Om denna typningsprocedur utförs sällan kan 15 mL substrat förvaras i provrör med skruvlock och smältas för att gjuta en agarplatta inför användningen. Om flera typningar utförs samma dag kan plattan delas i fyra till åtta sektorer.

1. Ta en liten del av en jästkoloni med en plastögla, platinaspets eller agarkniv (tillhamrad platinatråd) och dra parallella rispor i agarmediet för att provocera mycelbildning. Placera ett sterilt täckglas över inokulatet.

2. Inkubera vid 27-30 °C i upp till tre dagar.

3. Efter 48 tim. odling kan plattan avläsas mikroskopiskt. Börja med låg förstoring, senare med 40x objektiv.

Candida-arter med undantag av Candida glabrata bildar vanligen rikligt med pseudohyfer, ibland äkta mycel, som växer ut i substratet från kanten av inokulatet. Grupper av ovala till sfäriska blastokonidier kan ofta iakttas längs hyferna. Hyfernas och blastokonidiernas inbördes placering är ofta karakteristiska för den enskilda arten. Stora, starkt refraktila, tjockväggiga klamydokonidier kan iakttas i änden eller på korta sidogrenar av hyfer hos C. albicans och C. dubliniensis.

Biokemiska tester och specialsubstrat (Tabell 9)[redigera]

Kolhydratfermentationstester är diskriminerande särskilt ihop med assimilationstester (se Tabell 10).

Referensmetodik[redigera]

Fermentation[redigera]

Princip

Jästsvampens förmåga att jäsa vissa sockerarter påvisas med gasbildning. Gasen fångas upp i små upp-och-nervända durhamrör i jäsningsrören. Olika arter har skilda jäsningsmönster, skillnad även med avseende på hur starkt och hur snabbt sockerarten fermenteras. Detta markeras i referensböckerna med “w” för weak och “d” för delayed efter aktuell sockerart för de olika svamparna.

Utförande

Jästsvampen slammas i NaCl till en täthet av ca 1 McFarland, 1 droppe inokuleras till varje sockerjäsningsrör (Bilaga 3), inkuberas vid 25-30 °C och studeras med 2-3 dagars mellanrum upp till 10 dagar, varvid omskakas för att notera ev. begynnande jäsning. Denna ses som små gasbubblor som stiger i röret. Om jästen använder sockret i röret aerobt växer den i övre delen av röret och adapteras till sockret ifråga. Den adapterade jästen sjunker till botten där syrekoncentrationen är låg. Här kan sockret metaboliseras anaerobt och CO₂-bubblor stiger upp i det inverterade röret. Jäsningsförmågan mäts genom att notera hur mycket gas som bildats, hur snabbt och från vilka sockerarter. Rekommenderade socker är D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos, laktos, trehalos och raffinos.

Assimilation[redigera]

Princip

Bestämning av förmågan hos jästsvamp att använda en enda kolkälla (sockerart) vid aerob växt. Assimilation betyder att svampen tar upp och bryter ner sockret ifråga. Denna förmåga undersöks genom att tillsätta svampen till en kolhydratfri agar och därefter tillföra sockerarter. Växt runt sockerarten visar att svampen har förmåga att assimilera denna.

Utförande

Jästsvampen slammas i NaCl till ca 2 McFarland. 0,5 mL av denna suspension hälls i en petriskål (9 cm diameter). Tillsätt ca 10 mL smält avsvalnad (40-42 °C) assimilationsagar (Bilaga 3). Blanda agarn och svampsuspensionen noga genom att snurra plattan med- och motsols. Lägg de olika sockren (en knivsudd kristaller alt. sockerimpregnerade lappar) vid kanten på plattan när denna har stelnat. Fem olika sockerfår plats på varje platta. Antalet sockerarter som testas kan variera. För att få säker diagnostik bör dock minst 16 testas.

Följande rekommenderas: D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos, laktos, cellobios, trehalos, melibios, raffinos, melezitos, xylos, L-sorbos, erytritol, D-mannitol, D-glucitol (=D-sorbitol) och inositol. Assimilationsmönster (auxanogram) fås genom att notera vilka socker svampen kan utnyttja för tillväxt. Plattorna inkuberas 2 dygn i 25-30 °C. Assimilation ses som en växtzon runt respektive sockerart. För tolkning av resultaten, se referenslitteraturen, t.ex. Barnett et al.

RAT-test (Rapid Assimilation of Trehalose) utförs för att snabbidentifiera Candida glabrata[redigera]

Kolonier som testas skall ha små rundovala blastokonidier och ej pseudomycel. Svampkolonierna bör vara 2-4 dagar gamla. Endagarskolonier blir ofta negativa.

1) Häll 2-3 pasteurdroppar RAT-medium (Bilaga 3) till en mikrotiterplatta, en brunn per test.

2) Slamma en full 1 µL-ögla jästsvamp till brunnen. Tjockt inokulat är viktigt för testets sensitivitet.

3) Inkubera plattan med lock i 37 °C 1-11/2 timme. Ta med C. glabrata (ATCC 90030) som positiv kontroll och C. albicans (ATCC 90028) som negativ kontroll vid varje testtillfälle.

4) Vid posisiv test för C. glabrata ändrar mediet färg från blått till gult/gulgrönt. Negativ test utesluter ej C. glabrata.

Nitratassimilation utförs antingen analogt med kolhydratsassimilation men med kvävefri agar eller används MKA-rör som inokuleras med en jästkoloni och inkuberas vid 25-30 °C, 2 dygn. Vid positiv assimilation ändras substratets färg från grön till blå (Bilaga 3).

Speciella tester för C. neoformans[redigera]

Kryptokockkolonin är vitbeige, ofta slemmig p.g.a. kapseln. Äldre (1 vecka) kolonier blir bruna. Alla kryptokocker är icke-fermentativa aerober.

Fenoloxidasaktivitet, d.v.s. bildningen av melaninliknande pigment (orto-och parafenoler) används för snabb preliminär identifiering av C. neoformans. Många olika substrat kan användas för att påvisa melaninbildning, t.ex. dopamin och dihydroxyfenylalanin (DOPA).

Förmåga att bilda bruna kolonier på dessa substrat är tecken på förekomst av fenoloxidas (Bilaga 3).

Agarplattor med DOPA-medium inokuleras med misstänkt koloni C. neoformans och inkuberas vid 20-30 °C i minst 3 dagar. C. neoformans framträder som mörkbruna till svarta kolonier. Positiv och negativ kontroll odlas på varje platta (bilaga 4).

Ureahydrolys: Ureasbildning är ett karakteristikum, som är användbart för att identifiera kryptokocker och flera andra basidiomycetjästarter. Alla Rhodotorula och de flesta Trichosporon-arter bildar också ureas. Mediet är Christensens ureaagar (Bilaga 3) som även används för bakterier. Ett rör med ureamedium inokuleras med en ögla jästmaterial. Det är lämpligt att lägga till en positiv och negativ kontroll (bilaga 4). Rören inkuberas vid 25-30 °C. En rosa färg uppträder efter 2-5 dagar vid positiv reaktion p.g.a. alkaliskt pH genom ammoniakbildning.

Diagnostiska kits[redigera]

Med den ökande kunskapen om att svampars genus- och speciestillhörighet också ger relativt säker terapeutisk vägledning har ett stort antal produkter för typning av jästisolat utvecklats och saluförts. De bygger oftast på assimilation eller identifiering av karakteristisk enzymbildning, den senare kräver ibland induktion på specifika medier. Stor följsamhet till producentens anvisningar om inokulat och inkuberingsförhållande krävs i allmänhet för goda resultat. Exempel på kits är Vitek, ID32C och API20 Caux (alla från BioMérieux). På svenska mykologiska laboratorier har "in house" metoderna (jäsning och assimilation) i huvudsak ersatts med Vitek eller ID32C kits. Resultaten bör, vid behov, verifieras med mikromorfologi och ev. andra metoder.

Kommersiella snabbtester[redigera]

Det finns en kommersiell latex agglutinationstest, Bichro-Latex albicans, för gruppidentifiering av Candida albicans och Candida dubliniensis från Fumouze Diagnostics. Denna test kan användas i stället för serumtest (bildning av groddslangar) på isolerade kolonier. Positiv agglutination tyder på att stammen är antingen C. albicans eller C. dubliniensis. Fördelen med agglutination är att den tar bara 5 min att utföra.

För att särskilja C. dubliniensis från C. albicans kan en annan agglutinationstest, Bichro-Dubli (Fumouze Diagnostics) användas. Latexpartiklarna är täckta med monoklonala antikroppar mot C. dubliniensis ytantigen. Denna test är både känslig och specifik för artidentifiering av C. dubliniensis.

För artidentifiering av Candida krusei finns en latex agglutinationstest, Krusei-Color (Fumouze Diagnostics). Latexpartiklarna är täckta med monoklonala antikroppar som medger specifik identifiering av C. krusei.

För identifiering av Candida glabrata kan en snabb trehalostest, Glabrata R.T.T. (Fumouze Diagnostics) användas. Denna test bygger på C. glabrata jästens förmåga att kunna snabbt hydrolysera trehalos till glukos. Fördelen med denna test jämfört med in-house trehalostest (RAT-test) är att Glabrata R.T.T. testkortet innehåller, förutom brunnen med trehalos, två kontrollbrunnar, en med maltos och en med enbart basmedium, för att öka testens specificitet.