Influensa A, B-laboratoriediagnostik

Till huvudartikel Influensa A, B

---

Artiklen är uppdaterad januari 2010

Laboratoriediagnostik av influensa A och B

Allmänt

De viktigaste metoderna för influensadiagnostik är agenspåvisning genom antigendetektion, odling eller PCR. IgM-svaret vid influensainfektion är varierande, och analys av specifikt IgM har låg diagnostisk signifikans.

Virusodling

Influensavirus odlas vid enstaka laboratorier, främst i en cellinje från hundnjure, Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler. Olika typer av patientmaterial från luftvägarna kan användas. Odling är ofta ett komplement till PCR eller antigendetektion, och i Sverige används oftast nasofarynxaspirat för undersökningarna. Virus finns i svalg och näsa, och utomlands används ofta material från svalgpinne eller näsprov i virusmedium för virusodling.

Virusodling anses fortfarande vara referensmetod för detektion, och vid optimal metodik kan den nästan uppnå samma känslighet som PCR. Som alla isoleringsmetoder kräver den extremt noggrann kvalitetskontroll, inte minst monitorering av cellernas känslighet. I samband med provsättning krävs också byte till cellmedium med tryspin för att klyva H. Om inte detta sker kan inte virusgenomet frigöras i cellen. Trypsin av hög kvalitet kan ibland vara svårt att få tag på.

Övrig diagnostik

a) Nukleinsyrapåvisning

Såväl ute i världen som i Sverige börjar genomamplifikation, ofta med realtids-teknik, att ersätta andra metoder för influensapåvisning. I samband med pandemin 2009 visade sig att det var extra stort behov av påvisning med mycket hög känslighet. Detta då den nya influensan har en högre tendens att orsaka viral lunginflammation. Vissa patienter kunde då ha låga viruskoncentrationer i NPH initialt trots svår sjukdom. I samband med denna pandemi gick merparten av alla svenska laboratorier över till PCR diagnostik. Matrix-genen och H-genen används ofta som målgener för primers. SYBR-green för detektion ger en relativt god känslighet, och gör testet mera okänsligt för sekvensvariationer än en specifik probe. Dock kan SYBR-greenanalyser upplevas som svåravlästa och ospecifika.

Eftersom influensavirus ständigt förändras är det viktigt att följa upp nukleotidvariationerna som sker i de regioner som amplifieras vid PCR. Idag finns flera databaser för influensa sekvenser, den största är GISAID. Kommersiella tester finns, men används ännu inte i någon stor omfattning. En del är multiplexa, med reagenser för många luftvägsvirus.

b) Antigendetektion

I Sverige används vid flera laboratorier IF på cellpreparat från nasofarynx-aspirat eller nasofarynxpinne för antigendetektion. Metoden är snabb om bara ett fåtal prover skall analyseras. Kommersiella antikroppar används, och såväl direktmärkta som omärkta monoklonala antikroppar finns att tillgå. Testets känslighet jämfört med virusodling ligger på mellan 60 och 90 %, i medeltal sannolikt ca 80 %. Utstryk från pinne ger något lägre känslighet än utstryk av nasofarynxaspirat, men den exakta skillnaden är inte undersökt – få patienter går med på två nasofarynxprovtagningar! Specificiteten brukar vara ca 95 %. Testerna är ofta något sämre för influensa B än influensa A. Direktmärkta antikroppar ger något lägre känslighet än indirekta tester, men dessa tar kortare tid och kan ge mer ospecifik bakgrund.

Det finns ett flertal kommersiella tester för antigendetektion baserade på EIA-teknik avsedda för såväl laborartoriebruk som patientnära analys. De i Sverige förekommande bygger på antigen/antikroppsreaktioner. De flesta kommersiella testerna innehåller antikroppar som riktas mot nukleokapsiden, och är typspecifika för influensa A eller B. Några påvisar både influensa A och B. Prövningar av testen i stor skala med patientnära analyser har inte gjorts i Sverige, men enligt rapporter från andra länder blir resultaten sämre när testerna utförs av personer utan laboratorievana.

Vid tidigare panelutskick (EQUALIS) och vid pandemin 2009 visar de då använda snabbtesterna dålig känslighet jämfört med andra metoder. Prover som blivit negativa vid analys med snabbtest bör analyseras med annan metod med högre känslighet innan det svaras ut.

c) Serologi

IgM-serologi är opålitlig, och diagnostik bygger på titerstegring mellan akut och konvalescentprov. Många metoder används, men ingen är optimal. Hemagglutninations-inhibitionstest (HAI; se nedan) får anses som referensmetod, och har vid stora studier en känslighet på ca 80 % jämfört med virusisolering. HI kan skilja mellan antikroppar mot olika subtyper av influensa A. ELISA-metoder bygger ofta på cellodlat, renat influensavirus, och innehåller ofta även kontroll-antigen. De är typspecifika men inte subtypspecifika. Känsligheten är jämförbar med HI. Komplementbindning för influensaantikroppar används fortfarande, men har inga fördelar jämföret med ELISA. Serologi avseende influensa är relativt okänslig och sällan informativ under akutskedet, då behandling är möjlig. Därför bör man sträva efter att lämpligt prov tas för viruspåvisning när patienten är sjuk, även om serologiskt prov tas.

Stamkarakterisering

För att ta reda på om det uppstått ett nytt virus, eller om virus förändrats så att ett vaccin blivit ineffektivt, använder man fortfarande mycket traditionella, serologiska tester. Man immuniserar ett djur, numera mest iller, med ett influensavirus. Serum från dessa innehåller antikroppar som bara reagerar med H som mycket liknar H på det virus man immuniserat med. H från influensa klumpar ihop, agglutinerar, röda blodkroppar från exempelvis kycklingar. Om det finns skyddande antikroppar förhindrar dessa att blodkropparna klumpas ihop. Detta kallas hemagglutinationsinhibition (HAI). HAI är fortfarande den vanligaste metoden för att undersöka släktskap mellan olika influensastammar, och om personer har skyddande antikroppar mot en viss influensastam. Fullständig karakterisering med HAI kräver tillgång till en stor mängd olika illersera, och sker vid WHO:s referenslaboratorier.

Begränsad typning och genetisk analys sker vid nationella influensacentra. På Folkhälsomyndigheten brukar cirka 40 stammar/år brukar analyseras, med fokus på prover mycket tidigt och mycket sent under säsongen samt vid speciella utbrott. Vid Folkhälsomyndigheten görs så snart som möjligt analys av subtyp och H och N sekvenseras - dessa genanalyser sammanställs i fylogenetiska träd. Vid ett par tillfälles skickas isolat till WHO:s regionala influensalaboratorium i Europa vid Mill Hill i London, där HAI mot ett flertal serum görs. Om något isolat verkar avvika från de för säsongen förekommande vid den screeningsundersökning som görs vid Folkhälsomyndigheten skickas det omgående till England.

Resistensbestämning och resistensutveckling

Sedan de nya antivirala medlen kom bör bedömning avseende resistens mot dessa göras fortlöpande. Detta görs genom NA-sekvenseringen, då vissa resistensmutationer för N är kända. För somliga isolat görs också konventionell (fenotypisk) resistensbestämning mot zanamivir och oseltamivir.

Kvalitetskontroll

EQUALIS tillhandahåller paneler för genamplifikation. UKNEQAS har en luftvägspanel för virusodling, i vilken influensa kan ingå. Europeiska nationella influensacentra deltar i kontroll av virusodling genom EISS (European Influenza Surveillance System).. QCMD gör PCR-paneler för influensa A och B samt subtypningsspecifika analyser.