Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)
Artikel publicerad april 2012, innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)[redigera]
LAMP-tekniken har kommit att användas i kliniskt bruk under senare år och används till exempel i ett kommersiellt test för detektion av Clostridium difficile. Metoden är isotermal, amplifieringen sker snabbt vid temperaturer runt 60-65° C under 30-60 minuter. Avläsningen av resulatet sker direkt från amplifieringsröret i ett enkelt instrument som mäter grumligheten i provet (turbidimetri). Det bildas ett vitt precipitat i röret då kopiering av målsekvensen skett som gör att provet blir grumligt. Det vita precipitatet består av magnesiumpyrofosfat som bildas då pyrofosfatjoner frigörs som en biprodukt under uppbyggnaden av nytt DNA. En ökning av turbiditeten (grumligheten) korrelerar med mängden amplifierad produkt i röret, och mäts i realtid under amplifieringen. Enzymet som används för reaktionen är ett ”DNA strand displacement polymerase”. Enzymet är inte så känsligt för inhibitorer i provet och ger därför en stabil amplifieringsprocess även av prover där mål- DNA:t inte är helt rent.
LAMP-metoden bygger på amplifiering med långa nukleotidprimers som inte är så känsliga för nukleotidvariationer i sekvensen, vilket ger få falskt negativa resultat. Fyra olika primers, som känner igen totalt 6 distinkta målsekvenser i templat-DNA, används per reaktion. Detta ger metoden en hög specificitet. En inre primer som känner igen sekvenser på både sense-och antisensesträngen av mål-DNA initierar LAMP-reaktionen. Sedan sker ”strand displacement” DNA-syntes med hjälp av en yttre primer. En enkelsträngad DNA-molekyl släpps då fri. Denna enkelsträngade molekyl används sedan som templat för nästa DNA-syntes som startar då det andra primerparet binder in, hybridiserar, till den andra änden av molekylen. Kopieringen av sekvensen, "LAMP-cyklingen", sker runt en ”stem-loop” eller hårnålsstruktur, som är skapad av komplementära primersekvenser. Cyklingen sker automatiskt i provet då nya DNA-strängar ersätts under DNA-syntesen (”auto-cycling strand displacement DNA synthesis”).
Amplifieringseffektiviteten är hög med LAMP-tekniken, inga temperaturförändringar krävs för reaktionen och enzymet tillåts arbeta vid optimal temperatur under hela den tid som processen pågår.
REFERENSER[redigera]
- Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 2000;28(12):e63.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications 2001;289:150-154.
- Tomita N, Mori Y, Kanda H, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols 2008;3:877-882.
- Norén T, Alriksson I, Andersson J, Akerlund T, Unemo M. Rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification test for Clostridium difficile detection challenges cytotoxin B cell test and culture as gold standard. J Clin Microbiol 2011;49(2):710-711.