Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad april 2012, innehÄllet Àr preliminÀrt i vÀntan pÄ konsensusförfarande


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik


Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

LAMP-tekniken har kommit att anvĂ€ndas i kliniskt bruk under senare Ă„r och anvĂ€nds till exempel i ett kommersiellt test för detektion av Clostridium difficile. Metoden Ă€r isotermal, amplifieringen sker snabbt vid temperaturer runt 60-65° C under 30-60 minuter. AvlĂ€sningen av resulatet sker direkt frĂ„n amplifieringsröret i ett enkelt instrument som mĂ€ter grumligheten i provet (turbidimetri). Det bildas ett vitt precipitat i röret dĂ„ kopiering av mĂ„lsekvensen skett som gör att provet blir grumligt. Det vita precipitatet bestĂ„r av magnesiumpyrofosfat som bildas dĂ„ pyrofosfatjoner frigörs som en biprodukt under uppbyggnaden av nytt DNA. En ökning av turbiditeten (grumligheten) korrelerar med mĂ€ngden amplifierad produkt i röret, och mĂ€ts i realtid under amplifieringen. Enzymet som anvĂ€nds för reaktionen Ă€r ett ”DNA strand displacement polymerase”. Enzymet Ă€r inte sĂ„ kĂ€nsligt för inhibitorer i provet och ger dĂ€rför en stabil amplifieringsprocess Ă€ven av prover dĂ€r mĂ„l- DNA:t inte Ă€r helt rent.

LAMP-metoden bygger pĂ„ amplifiering med lĂ„nga nukleotidprimers som inte Ă€r sĂ„ kĂ€nsliga för nukleotidvariationer i sekvensen, vilket ger fĂ„ falskt negativa resultat. Fyra olika primers, som kĂ€nner igen totalt 6 distinkta mĂ„lsekvenser i templat-DNA, anvĂ€nds per reaktion. Detta ger metoden en hög specificitet. En inre primer som kĂ€nner igen sekvenser pĂ„ bĂ„de sense-och antisensestrĂ€ngen av mĂ„l-DNA initierar LAMP-reaktionen. Sedan sker ”strand displacement” DNA-syntes med hjĂ€lp av en yttre primer. En enkelstrĂ€ngad DNA-molekyl slĂ€pps dĂ„ fri. Denna enkelstrĂ€ngade molekyl anvĂ€nds sedan som templat för nĂ€sta DNA-syntes som startar dĂ„ det andra primerparet binder in, hybridiserar, till den andra Ă€nden av molekylen. Kopieringen av sekvensen, "LAMP-cyklingen", sker runt en ”stem-loop” eller hĂ„rnĂ„lsstruktur, som Ă€r skapad av komplementĂ€ra primersekvenser. Cyklingen sker automatiskt i provet dĂ„ nya DNA-strĂ€ngar ersĂ€tts under DNA-syntesen (”auto-cycling strand displacement DNA synthesis”).

Amplifieringseffektiviteten Àr hög med LAMP-tekniken, inga temperaturförÀndringar krÀvs för reaktionen och enzymet tillÄts arbeta vid optimal temperatur under hela den tid som processen pÄgÄr.

REFERENSER

  • Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 2000;28(12):e63.
  • Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications 2001;289:150-154.
  • Tomita N, Mori Y, Kanda H, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols 2008;3:877-882.
  • NorĂ©n T, Alriksson I, Andersson J, Akerlund T, Unemo M. Rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification test for Clostridium difficile detection challenges cytotoxin B cell test and culture as gold standard. J Clin Microbiol 2011;49(2):710-711.