MLVA

Hoppa till: navigering, sök

Artikel under bearbetning


Artikel publicerad april 2012. InnehÄllet preliminÀrt i vÀntan pÄ konsensusförfarande


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik


Multiple locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA)

AllmÀnt

Den epidemiologiska typningsmetoden Multiple locus VNTR analysis (MLVA), dÀr VNTR stÄr för variable number tandem repeats, detekterar för respektive art som studeras utvalda omrÄden i genomet (locus, pl loci) med repeterade sekvenser. DÄ antalet repetitioner varierar för olika isolat beroende pÄ epidemiologiskt samband kan detta anvÀndas för slÀktskapsanalyser. Vanligt Àr att omkring tio primerpar anvÀnds för PCR-detektion av lika mÄnga loci som i sin tur innehÄller varierande antal repetitioner hos stammar med olika ursprung. Exempel pÄ bakteriearter som kan typas epidemiologiskt med den hÀr tekniken Àr Mycobacterium tuberculosis (tekniken kallas dÄ MIRU-VNTR), Pseudomonas aeruginosa och bakterier inom familjen Enterobacteriaceae som Escherichia coli.


Vid epidemiologisk typning av Escherichia coli detekteras sju loci i bakteriegenomet med PCR. Dessa loci innehÄller lika antal repetitioner för de isolat som har gemensamt ursprung men varierande antal repetitioner hos stammar med olika ursprung. PCR för sju loci kan utföras som singelreaktioner varefter resultatet analyseras pÄ agarosgel tillsammans med storleksmarkör för att antalet repetitioner i varje locus ska kunna berÀknas. I nedan beskrivna metodik anvÀnds mÀrkta primrar för PCR och flera av reaktionerna kan dÄ utföras i samma PCR-rör, sÄ kallad multiplex PCR. För storleksbestÀmning av de bildade DNA-fragmenten och för berÀkning av antalet repetitioner anvÀnds sekvensutrustning som kan detektera och storleksbestÀmma de bildade DNA-fragmenten.

Utförande av MLVA för epidemiologisk typing av Escherichia coli

De sju loci som detekteras Àr: CVN001; CVN002; CVN003; CVN004; CVN007; CVN014 och CVN015. Primersekvenserna för detektion anges i tabell 1 och Àr kombinerade i tre olika PCR-analyser. SammansÀttningen av mastermixen för varje multiplex-PCR anges i tabell 2.


Templatet för varje mastermix Àr en kokt och hastigt centrifugerad bakteriesuspension. För amplifieringen anvÀnds instrumentet GeneAmp 9700 termocycler (Applied-Biosystems). De bÄda multiplexreaktionerna M1 och M2 sker i 95°C i 15 min, dÀrefter 25 cycler 94°C i 30 sek, 63°C i 90 sek och 72°C i 90 sek och programmet avslutas med 72°C i 10 min. Reaktionen M3 sker separat och inleds med 94°C i 5 min, dÀrefter 30 cycler vid 94°C i 30 sek, 50°C i 30 sek och 72°C i 50 sek och hela programmet avslutas med 72°C i 7 min.

Efter PCR-amplifiering poolas PCR-produkterna enligt följande:

  • Elektrofores A. FrĂ„n M1 tas 2,5 ”L och frĂ„n M3 tas 2 ”L som blandas med med 30 ”L vatten. FrĂ„n denna mix tas 1 ”L till 0,5 ”L Genflo-625 TAMRA (CHIMERx) intern standard och 12 ”L formamid för elektrofores i ABI-310 Genetic analyser (Applied Biosystems).
  • Elektrofores B. FrĂ„n M2 tas 1 ”L till 50 ”L vatten som blandas med Genflo-625 TAMRA och formaid enligt ovan.

Tabell 1

MLVA1.jpg

Tabell 2

MLVA2.jpg

Analys av sekvenseringsresultatet

Varje topp identifierad av instrumentet motsvaras av ett locus. Detta storleksbestÀms med hjÀlp av standarden. Dess storlek Àr avhÀngigt antalet repetitioner i fragmentet. Slutsvaret för varje isolat innebÀr en sju-siffrig nummerserie motsvarande antalet repetitioner dvs lÀngden av vart och ett av de sju omrÄden som amplifierats och storleksbestÀmts.

REFERENSER

  • Lindstedt B et al. Study of polymorphic variable-number of tandem repeats loci in the ECOR collection and in a set of pathogenic Escherichia coli and Shigella isolates for use in a genotyping assay J Microbiol Methods. 2007 Apr;69(1):197-205.