MRSA-screening enligt Halmstadmodellen

Hoppa till: navigering, sök

Artikel uppdaterad april 2012


Till förgreningssidan MRSA


MRSA-screening enligt ”Halmstadmodellen”

Introduktion

Metoden gör det möjligt att utesluta förekomst av MRSA i 80-90 % av negativa prover inom ett dygn. Övriga prover odlas ytterligare ett eller tvĂ„ dygn innan de kan slutsvaras. För att Ă„stadkomma detta odlas provet i en selektiv buljong (4 mg/L cefoxitin) över natt. Antalet S. aureus celler i buljongen bestĂ€ms sedan med en kvantitativ realtids-PCR baserad pĂ„ nuc-genen enligt Brakstad et al,^1 modifierad av Nilsson et al.^2 Principen bygger pĂ„ att MRSA anrikas till pĂ„visbara nivĂ„er över cutoff, medan kĂ€nsliga stammar gör detta i mycket mindre utstrĂ€ckning. Specificiteten i PCR-steget Ă€r 80-90 %. De prover som innehĂ„ller S. aureus-antal under en definierad cutoff svaras ut som negativa. Övriga odlas ut pĂ„ fasta substrat för MRSA-identifiering.


Prover som utfallit positiva med denna metod verifieras i en uppföljande PCR som beskrivs i artikeln Genotypisk MRSA-verifiering.

Anrikning och provpreparation

Provpinnen eller 50 ”L urin inokuleras i 3-5 mL FOX-buljong.

  • Recept: FOX-buljong
    • proteos peptone (Oxoid L85)----- 15,0 g/L
    • liver digest (Oxoid L27)----- 2,5 g/L
    • yeast extract (Oxoid L21 ----- 5,0 g/L
    • NaCl (Merck) ---------- 25,0 g/L
    • mannitol (Scharlov) ----- 10,0 g/L
    • phenyl red (Merck) ----- 16 mg/L
    • Cefoxitin (Sigma) ----- 4,0 mg
    • Aztreonam (Bristol-Meyers Squibb)----- 8 mg
  • pH 7,0 ± 0,1 vid 25 °C


Inkubera ocksĂ„ tunt inokulat av MRSA-kontrollstam CCUG35600 i ett rör som positiv preparationskontroll av nuc-genen. Inkubera 37 °C i skakinkubator (110 rpm) minst 16 timmar. Efter inkubering vortexas odlingen (undvik aerosol) och 100 ”L förs över till sterilt 1,5 mL eppendorfrör. Om prover skall ”poolas” tag 100 ”L av varje (högst 3 prover per pool) till ett rör. Centrifugera röret 14 000 rpm 3 minuter och avlĂ€gsna genast överfasen. Resuspendera pellet i halva ursprungsvolymen StafLys (20 mM Tris-HCl pH 7,6 (Sigma), 0,5 % Tween20 (Sigma), 0,5 % Igepal CA-630 (Sigma) och 60 ”g/mL Proteinase K (Roche Diagnostics)). Inkubera sedan röret 56 °C 60 minuter följt av 5 minuter 95-99 °C. Centrifugera provet 10 000 rpm 1 minut inför PCR-analys.

MĂ€ngdstandard

MĂ€ngdstandard bereds i korthet frĂ„n en övernattsodlad BHI-kultur av MRSA CCUG 35600. Med ”viable counts” bestĂ€ms CFU/mL för suspensionen varefter celler lyseras pĂ„ samma sĂ€tt som proverna. Lysatet spĂ€ds sedan i StafLys utan proteinase K till lĂ€mpliga koncentrationer utifrĂ„n ”viable count”-resultat (t.ex.10^8, 10^6, 10^5, 10^4 CFU/mL).

Alternativt kan en mÀngdstandard beredas frÄn isolerat och koncentrationsbestÀmt kromosomalt DNA frÄn en S. aureus kontrollstam.

Kvantitativ nuc-PCR

Genom att analysera fyrapunkters mÀngdstandard parallellt med proverna kan antalet S. aureus-celler/mL i buljongerna bestÀmmas. Buljonger som innehÄller fÀrre Àn 10^4 CFU/mL svaras ut som negativa, 10 ”L av övriga buljonger odlas ut pÄ fast substrat lÀmpliga för identifiering av S. aureus.

Reaktionsvolymen Ă€r 25 ”L, anvĂ€nd 5 ”L templat. Mastermixen innehĂ„ller 1 x Quanta Perfecta qPCR Fast mix (WWR), 0,9 ÎŒM vardera av primrar NUC4 och NUC5 samt 0, 25 ÎŒM av TaqMan-prob NUC-RQ.

Primer-och probsekvenser (4)

    • NUC4 5ÂŽ- TCA AGT CTA AGT AGC TCA GCA AAT GC –3ÂŽ
    • NUC5 5ÂŽ- GAA GTT GCA CTA TAT ACT GTT GGA TCT TC –3ÂŽ
    • NUC-RQ 5ÂŽ-FAM-TCA CAA ACA GAT AAC GGC GTA AAT AGA AGT GGT TCT - TAMRA -3


  • Temperaturprofil i RotorGene Q/6000
    • Enzymaktivering- 95 °C 3 minuter.
    • Amplifiering och detektion- 95 °C 3 sekunder. 65 °C 20 sekunder.
    • FluorescensmĂ€tning Green channel 40 cykler.

Verifiering av MRSA

Prover som utfallit positiva med denna metod verifieras i en uppföljande PCR som beskrivs i artikeln Genotypisk MRSA-verifiering.

REFERENSER

  • 1.Brakstad et al. 1992. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J Clin Microbiol. 30: 1654-1660.
  • 2.39th Annual Meeting of the Infectious Society of America. 2001. San Fransisco paper n.o. 183: MRSA detection in patients in less than 24 h with a Light Cycler (Roche) real-time PCR-based method. Nilsson, P, & Ripa, T.
  • 3. Nilsson, P., H. Alexandersson, and T. Ripa. 2005. Use of broth enrichment and real-time PCR to exclude the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in clinical samples: a sensitive screening approach. Clin Microbiol Infect. 11:1027-34.
  • 4. Ej publicerad egen design av TaqMan-PCR. Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad.