Maldi-Tof

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad maj 2012


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Bakteriologisk diagnostik av infektioner i hud, mjukdelar, skelett och inre organ

och

artiklarna Identifiering av bakterier i rutindiagnostik och minimikriterier


Taxonomi och typningsmetoder

Med taxonomi avses den systematiska indelningen av mikroorganismer som baseras pÄ klassifikation (inbördes likhet i grupper), nomenklatur (benÀmning/etikettering) och identifikation (diagnostisk process dÀr egenskaper hos den okÀnda mikroben jÀmförs med för viss art/genus accepterade kriterier).

Tyngdpunkten i tidiga klassificeringssystem har förutom beskrivning av vÀxtsÀtt legat pÄ morfologiska kriterier. Genom att sedan följa ett biokemiskt testschema i en speciell ordning med dikotomiskt utfall i positivt respektive negativt resultat kan en uppdelning ske ned pÄ artnivÄ. Detta ligger till grund för det vi i vanligt tal anger som minimikriterier. Med detta system nÄr man en hög grad av specificitet.

Problem uppstÄr dÄ en okÀnd mikroorganism inte faller ut i ett sÄdant schema. Genom att skapa databaser för biokemisk artidentifiering baserad pÄ ett stort antal fenotypiska reaktioner och testat pÄ ett mycket stort antal stammar, t.ex. API, har man smÄningom löst problemet att kvantifiera sannolikheten för att ett isolat tillhör en viss art/genus/grupp. FörutsÀttningen för korrekt diagnos Àr att isolatets morfologi (mikro- respektive makroskopiskt) och vÀxtsÀtt Àr förenligt med databasens förslag.

Ytterligare ett stort steg i taxonomins utveckling togs i slutet av 1980-talet dÄ man sÀkrat metoder för att faststÀlla art genom sekvensbestÀmning av hela genomet (DNA-DNA hybridisering). Denna fylogenetiska inriktning syftar till att faststÀlla slÀktskap och evolutionsmÀssigt avstÄnd mellan liknande mikroorganismer.

Eftersom det ÀndÄ kan finnas en mycket hög grad av likhet mellan olika arter vid t.ex. DNA-DNA hybridisering, har man pragmatiskt konstaterat att genotypiska och fenotypiska drag skall vÀgas samman (polyfasisk taxonomi).

De senaste Ärens snabba metodutveckling inom nukleinsyrabaserade metoder, bland annat 16 sRNA-sekvensering (PCR med sekvensering av den bakteriella genen för 16s rRNA.), och Maldi-Tof (Matrix-assisted-laser-desorption-ionisation Time-of-flight) har radikalt förÀndrat möjligheterna till sÀkrare diagnostik pÄ artnivÄ. Genom att rutinmÀssigt anvÀnda dessa typningssystem pÄ kliniskt mikrobiologiska laboratorier ökar ocksÄ möjligheten att snabbare identifiera ovanligare agens och korrelera dessa till kliniken.

Maldi-Tof

Redan idag har sÀkerheten för Maldi-Tof pÄ rena kolonier nÄtt en nivÄ som medger att tekniken kan anvÀndas rutinmÀssigt i den vardagliga artbestÀmningen. Med denna nya typningsmetod som möjliggör högre grad av upplösning pÄ artnivÄ Àn Àldre system stÀlls nya krav pÄ laboratoriet. Förutom test av kÀnda typstammar, dvs. de referensstammar som laboratoriet anvÀnder, bör jÀmförelser av typningsutfallet med den nya metoden och rutinmetoden utföras pÄ rutinprov, förslagsvis 400-500 prov med olika provtyper representerade. Vid diskrepans bör testning med ytterligare metod utföras som sÀkerstÀller identitet pÄ artnivÄ.

För Maldi-Tof metodik Ă€r den laborerande individens fĂ€rdighet vid provpreparation den enskilt viktigaste faktorn för att uppnĂ„ en hög score. De begrĂ€nsningar i systemen som finns idag avseende risk för felnavigering Ă€r vĂ€l kĂ€nda och redovisas av leverantörerna. Även om det Ă€r ovanligt med felidentifiering förekommer det att systemet inte anger nĂ„got alternativ, sannolikt p.g.a. att liknande stammar saknas i databasen. Vid lĂ„ga score-resultat kan ytterligare försök göras med Maldi-Tof efter extraktionsförfarande.

Inga signifikanta prestandaskillnader finns mellan idag tillgÀngliga system. Marginella diskrepanser ses för vissa bakteriegrupper beroende pÄ databasernas utformning. I takt med att databaserna successivt utvidgas kommer ytterligare species att identifieras sÀkert, framför allt avseende anaeroba bakterier och ovanliga mikroorganismer.

Vid validering av resultatet ingÄr att den föreslagna utsagan Àr förenlig med provtyp och basala observationer, dvs. vÀxtsÀtt, koloniutseende och ev. lukt. Vid osÀkerhet kontrolleras i första hand morfologin med gramfÀrgat preparat och ev. katalas- resp. oxidastest.

Nedan redovisas de idag kÀnda begrÀnsningarna med Maldi-Tof. DÄ det anges kan identifieras till artnivÄ, fungerar vÀl förutsÀtts att Maldi-Tof-algoritmen har uppnÄtt score-kriterier för sannolik art.

Enterokocker och streptokocker

  • Enterokocker kan identifieras till artnivĂ„
  • BetahĂ€molyserande streptokocker tillhörande Lancefield-grupper A, B, C och G kan identifieras till artnivĂ„. Beroende pĂ„ laboratoriets svarsrutin kan agglutination vara aktuell för Grupp C och G.
  • Pneumokocker benĂ€mns oftast korrekt men mĂ„ste kontrolleras med fenotypiska test (se nedan)
  • S.mitis-gruppen anges ofta felaktigt som pneumokocker.
  • Artdiagnostik inom Streptococcus anginosus-gruppen Ă€r möjlig för S. anginosus och S. constellatus, dock ej för Streptococcus intermedius.
  • Övriga alfastreptokocker kan typas pĂ„ gruppnivĂ„. För artnivĂ„ krĂ€vs sekvensanalys (t.ex. sodA). Speciellt viktigt inom S.bovis-gruppen (Grupp D) för isolat frĂ„n blododling p.g.a. olika species’ association till koloncancer, gallvĂ€gs- och pankreascancer samt kolangit.


Se ocksÄ Diagnostik av grampositiva, katalasnegativa kocker ("alfa-streptokocker")

Stafylokocker

  • De kliniskt viktigaste arterna S.aureus, S.epidermidis, S.lugdunensis, S.hominis, S. haemolyticus och S.simulans identifieras med hög sĂ€kerhet till art liksom S.saprophyticus, den senare dock med nĂ„got lĂ€gre score-vĂ€rden.
  • För S.intermedius/pseudintermedius och S.pettenkoferi saknas obunden publicerad information.

Gramnegativa kocker

  • N.gonorrhoeae och N.meningitidis kan typas till artnivĂ„.
  • För övriga Neisseriaceae spp Ă€r Maldi-Tof Ă€nnu inte optimalt.
  • Moraxella catarrhalis kan typas till artnivĂ„

Aeroba grampositiva stavar

  • ArtbestĂ€mning av Corynebacterium spp., inkl. C.diphtheriae fungerar vĂ€l. Detsamma gĂ€ller för Listeria, Rhodococcus, Arcanobacterium och Nocardia spp.
  • Oberoende redovisningar för artbestĂ€mning av Bacillus spp. saknas.

Enterobacteriaceae

  • Genus- och speciesbestĂ€mning fungerar för Enterobacteriaceae med fĂ„ undantag inom slĂ€ktena Serratia, Raoultella, Pantoea och Citrobacter.
  • Den viktigaste begrĂ€nsningen Ă€r att Shigella inte kan skiljas frĂ„n E.coli. Biokemisk verifikation och agglutination mĂ„ste utföras pĂ„ Shigella- misstĂ€nkta isolat.
  • Salmonella: Inga problem att nĂ„ genusnivĂ„. Maldi-Tof tekniken har potential att klara bestĂ€mning av sĂ„vĂ€l Salmonella species som subspecies. Till och med finns det goda möjligheter att screena för epidemiologiskt frekventa serovarer. De kommersiellt tillgĂ€ngliga databaserna Ă€r dock inte utbyggda för detta.
  • För Salmonella och Yersinia bör agglutination göras.
  • Vid invasiv sjukdom med vĂ€xt av Salmonella, exempelvis i blododling bör dessutom biokemisk analys utföras. Salmonella Typhi och Salmonella Paratyphi kan sannolikt identifieras med Maldi-Tof, dock saknas större material med obunden publicerad information.

Nonfermentativa gramnegativa stavar och HACEK-gruppen

  • Goda möjligheter till korrekt genus identifikation inom hela gruppen. Viss osĂ€kerhet finns för Stenotrophomonas (kan bero pĂ„ taxonomisk oklarhet visavi vissa Pseudomonas sp.).
  • Inom genus Pseudomonas, Aeromonas, Haemophilus, Pasteurella, Campylobacter, Vibrio, Legionella, Francisella och Bartonella erhĂ„lls species nivĂ„ i flertalet fall och med ett fĂ„tal felidentifieringar.
  • Inom Acinetobacter erhĂ„lls speciesnivĂ„ med hög sĂ€kerhet för A. baumanii, A. lwoffi, A. ursingii, A. radioresistens och Ac. Gen. Sp.3, dock saknas Ac. gen.sp. 13 TU i databasen.
  • HACEK-gruppen (Haemophilus parainfluenzae, Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens och Kingella kingae) kan identifieras pĂ„ genusnivĂ„ och i flertalet fall pĂ„ artnivĂ„ efter extraktion.
  • Maldi-Tof tycks kunna erbjuda god hjĂ€lp för typning inom Burkholderia-komplexet och andra mikroorganismer hos CF-patienter men ytterligare studier krĂ€vs.


Se ocksÄ Diagnostik av vissa sÀllan förekommande krÀvande gramnegativa stavar

Anaeroba bakterier

  • Identifiering pĂ„ genusnivĂ„ fungerar vĂ€l.
  • För Bacteroides, Prevotella och Clostridium sp. samt anaeroba grampositiva kocker fungerar Maldi-Tof i regel för artbestĂ€mning.
  • PĂ„ artnivĂ„ saknas delvis databasunderlag för Fusobacterium, Actinomyces och vissa Propionibacterium sp.

Klass 3-organismer

För dessa organismer finns sparsamt med publicerad information avseende Maldi-Tof prestanda.

Leverantören anger rÄd för inaktivering och preparation, dock ej specifikt för dessa organismer. Det finns obunden utvÀrdering publicerad men konsensus saknas kring detta. I nedanstÄende tabell framgÄr vilka agens som finns representerade (15 maj, 2012) i respektive databas.

AGENS MaldiBiotyper DB och SR Database-20^1 (Bruker) VITEK MS-ID V2 (bioMerieux)
Bacillus anthricis ja nej
Brucella sp ja nej
Burkholdieria mallei och pseudomallei ja nej
Francisella tularensis ja nej
Salmonella Typhi ja ja
Shigella dysenteriae ja nej
Yersinia pestis ja ja

^1Speciell riskdatabas