Microarray

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik


Microarray

Microarrayer anvÀnds inom mikrobiologin för tvÄ huvudÀndamÄl: genotypning och studier av genexpression. Genotypning anvÀnds för att identifiera och karaktÀrisera bakterier, svampar, virus och parasiter. Dessa arrayer framstÀlls ofta med DNA frÄn referensorganismer, vilket understryker en viktig begrÀnsning av microarray: detektionen Àr begrÀnsad till de sekvenser microarrayen innehÄller. Genexpression kan analyseras i sÄvÀl patogen sÄsom vÀrd, vilket möjliggör studier av bÄda sidor av patogen-vÀrd-interaktionen.

Microarray Àr en kraftfull teknologi med hög kapacitet för parallell analys och kvantifiering av ett stort antal nukleinsyramolekyler. Tekniken baseras pÄ att en stor uppsÀttning kÀnda nukleinsyror (DNA eller oligonukleotider) fÀsts pÄ en mikromatris, exempelvis ett objektglas eller en kiseldioxidyta. Hybridisering av fluorescensmÀrkta nukleinsyror i provet (mÄl-DNA, templat) till nykleinsyrorna pÄ mikromatrisen möjliggör, efter scanning av arrayen, analys av relativa koncentrationen av mRNA eller DNA i provet. Vid analys av genexpression eller RNA skrivs mRNA/RNA om till cDNA med omvÀnd transkriptas.

Det finns tvÄ huvudtyper av microarray: DNA-microarray och oligonukleotidmicroarray. DNA-microarray innebÀr att enkelstrÀngad eller frigjord dubbelstrÀngad DNA binds till mikromatrisen. DNAt i varje punkt Àr vanligtvis 300-800 nukleotider lÄngt. Vid genexpressionsanalys mÀrks bÄda templaten, test och kontroll, med tvÄ olika fluorokromer exempelvis Cy5 (röd) och Cy3 (grön). Microarrayen inkuberas sedan med bÄda templaten samtidigt och fluorescensmÀrkt DNA hybridiserar till mÄlsekvenser pÄ microarrayen med hög sensitivitet och specificitet. Microarrayen scannas dÀrefter och i varje punkt mÀts vardera fÀrgintensitet separat. Den med scannern uppmÀtta fÀrgintensiteten Àr proportionell till mÀngden DNA i provet. Vid genotypning analyseras enbart förekomst av DNA i provet och dÀrför krÀvs inte olika flourokromer.

Oligonukleotidmicroarrayer kan antingen produceras som ovan eller syntetiseras direkt in situ med tekniken fotolitografi till mikromatrisen. Oligonukleotiderna Àr ca 50-70 nukleotider lÄnga och det finns ett flertal olika sekvenser för varje gen. Detta leder till mer robusta och specifika analysresultat. DÄ DNA frÄn templaten enbart mÀrks in med en flourokrom krÀvs en array för sÄvÀl test- sÄsom kontrolltemplat, vilket leder till större mÀngder data att analysera vid genexpressionsanalyser.


Detektion och studier av mikroorganismer

Mikroorganismer kan med microarray identifieras antingen genom analys av DNA-innehĂ„ll eller genexpressionsprofil. Tekniken möjliggör analys av ett flertal patogener och/eller virulensfaktorer i en enda analys och Ă€r inte begrĂ€nsad till typ av organism. Kongenitala infektioner kan screenas med en microarray omfattande DNA frĂ„n herpes simplex virus, rubella, Treponema pallidum och Toxoplasma gondii. Vid analys av komplexa mikrobiella populationer som den gastrointestinala floran eller venösa bensĂ„r Ă€r microarray ett ovĂ€rderligt verktyg. Genom att analysera genexpressionsprofiler i vĂ€rdceller kan, Ă€ven i frĂ„nvaro av viabla eller detekterbara mikroorganismer, infekterande agens förutspĂ„s; ”genexpressionssignatur” för specifika patogener.

I kampen mot antimikrobiell resistens erbjuder microarray möjlighet till parallell analys av tusentals kÀnda och okÀnda resistensmutationer. Exempel inkluderar identifiering av mutationer som ger upphov för resistens hos S. pneumoniae, HIV och Candida. DÀrutöver kan antimikrobiella substansers verkan pÄ patogener studeras och till utveckling av nya substanser.

Microarray kan karakterisera stora och smÄ genomvariationer. DÀrigenom kan den anvÀndas för att sÀrskilja stammar vid epidemiologiska utredningar och för subtypning av mikroorganismer. För nÀrvarande finns kommersiell microarray tillgÀnglig för typning av bl a humant papillomvirus. I ett vidare perspektiv kan microarray anvÀndas för att undersöka evolution av mikroorganismer.

REFERENSER

  • Bryant PA, Venter D, Robins-Browne R, Curtis N. Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect Dis. 2004 Feb;4(2):100-11.