Microarray
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Microarray[redigera]
Microarrayer används inom mikrobiologin för två huvudändamål: genotypning och studier av genexpression. Genotypning används för att identifiera och karaktärisera bakterier, svampar, virus och parasiter. Dessa arrayer framställs ofta med DNA från referensorganismer, vilket understryker en viktig begränsning av microarray: detektionen är begränsad till de sekvenser microarrayen innehåller. Genexpression kan analyseras i såväl patogen såsom värd, vilket möjliggör studier av båda sidor av patogen-värd-interaktionen.
Microarray är en kraftfull teknologi med hög kapacitet för parallell analys och kvantifiering av ett stort antal nukleinsyramolekyler. Tekniken baseras på att en stor uppsättning kända nukleinsyror (DNA eller oligonukleotider) fästs på en mikromatris, exempelvis ett objektglas eller en kiseldioxidyta. Hybridisering av fluorescensmärkta nukleinsyror i provet (mål-DNA, templat) till nykleinsyrorna på mikromatrisen möjliggör, efter scanning av arrayen, analys av relativa koncentrationen av mRNA eller DNA i provet. Vid analys av genexpression eller RNA skrivs mRNA/RNA om till cDNA med omvänd transkriptas.
Det finns två huvudtyper av microarray: DNA-microarray och oligonukleotidmicroarray. DNA-microarray innebär att enkelsträngad eller frigjord dubbelsträngad DNA binds till mikromatrisen. DNAt i varje punkt är vanligtvis 300-800 nukleotider långt. Vid genexpressionsanalys märks båda templaten, test och kontroll, med två olika fluorokromer exempelvis Cy5 (röd) och Cy3 (grön). Microarrayen inkuberas sedan med båda templaten samtidigt och fluorescensmärkt DNA hybridiserar till målsekvenser på microarrayen med hög sensitivitet och specificitet. Microarrayen scannas därefter och i varje punkt mäts vardera färgintensitet separat. Den med scannern uppmätta färgintensiteten är proportionell till mängden DNA i provet. Vid genotypning analyseras enbart förekomst av DNA i provet och därför krävs inte olika flourokromer.
Oligonukleotidmicroarrayer kan antingen produceras som ovan eller syntetiseras direkt in situ med tekniken fotolitografi till mikromatrisen. Oligonukleotiderna är ca 50-70 nukleotider långa och det finns ett flertal olika sekvenser för varje gen. Detta leder till mer robusta och specifika analysresultat. Då DNA från templaten enbart märks in med en flourokrom krävs en array för såväl test- såsom kontrolltemplat, vilket leder till större mängder data att analysera vid genexpressionsanalyser.
Detektion och studier av mikroorganismer[redigera]
Mikroorganismer kan med microarray identifieras antingen genom analys av DNA-innehåll eller genexpressionsprofil. Tekniken möjliggör analys av ett flertal patogener och/eller virulensfaktorer i en enda analys och är inte begränsad till typ av organism. Kongenitala infektioner kan screenas med en microarray omfattande DNA från herpes simplex virus, rubella, Treponema pallidum och Toxoplasma gondii. Vid analys av komplexa mikrobiella populationer som den gastrointestinala floran eller venösa bensår är microarray ett ovärderligt verktyg. Genom att analysera genexpressionsprofiler i värdceller kan, även i frånvaro av viabla eller detekterbara mikroorganismer, infekterande agens förutspås; ”genexpressionssignatur” för specifika patogener.
I kampen mot antimikrobiell resistens erbjuder microarray möjlighet till parallell analys av tusentals kända och okända resistensmutationer. Exempel inkluderar identifiering av mutationer som ger upphov för resistens hos S. pneumoniae, HIV och Candida. Därutöver kan antimikrobiella substansers verkan på patogener studeras och till utveckling av nya substanser.
Microarray kan karakterisera stora och små genomvariationer. Därigenom kan den användas för att särskilja stammar vid epidemiologiska utredningar och för subtypning av mikroorganismer. För närvarande finns kommersiell microarray tillgänglig för typning av bl a humant papillomvirus. I ett vidare perspektiv kan microarray användas för att undersöka evolution av mikroorganismer.
REFERENSER[redigera]
- Bryant PA, Venter D, Robins-Browne R, Curtis N. Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect Dis. 2004 Feb;4(2):100-11.