Neisseria meningitidis (diagnostik)

Huvudartikel. Artikeln är sammanslagen av artiklar från CNS-, ÖLI och ögonböckerna. Reviderad av Hans Fredlund, Per Olcén och Magnus Unemo från Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro, 2012.

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar och förgreningssidan Neisseria meningitidis

Neisseria meningitidis, "meningokocker"

Smittämnet

Neisseria meningitidis är en aerob gramnegativ kock. Bakterierna förekommer ofta som diplokocker med konkava ytor riktade mot varandra, så att de i mikroskop är snarlika njurar/kaffebönor. Bakterien har en polysackaridkapsel vars kemiska struktur bildar basen för serogruppering (eller genogruppering) till serogrupperna A, B, C, X, Y, Z, W-l35, 29E, H, I, K och L. Invasiv sjukdom, som meningit och sepsis/bakteriemi orsakas oftast av serogrupp A, B, C, Y och W-135 hos för övrigt friska personer, medan invasiv sjukdom orsakad av andra serogrupper signalerar möjlig defekt i infektionsförsvaret.

Cellväggen är uppbyggd liknande som hos andra gramnegativa bakterier men har två olika porinsystem (grund för serotypning/genotyping och serosubtypning/genosubtypning) och osedvanligt potent och/eller mycket endotoxin (flera typer existerar). Detta kan medverka till kärlskada med blödningar (peteckier, eckymoser), septisk chock och eventuell död. Meningokocker sammanfattas tillsammans med genetiskt och morfologiskt närbesläktade gonokocker ofta under beteckningen "patogena Neisseria". Till genus Neisseria hör även ”apatogena” arter som t.ex. N. lactamica, N. sicca, N. subflava, N. mucosa, N. flavescens och N. cinerea. Flertalet av dessa tillhör normalfloran i framförallt övre luftvägarna och orsakar sjukdom endast i undantagsfall, t.ex. hos immunosupprimerade. Neisseria meningitidis kräver näringsrika substrat och fuktig miljö med cirka 4-6 % koldioxid för tillväxt. Bakterien producerar enzymerna oxidas och katalas, och saknar flageller för motilitet.

Patogenes

Meningokocker är strikt humanpatogena och utgör en del av den normala bakteriefloran i svalg/övre luftvägar hos uppskattningsviss 10-30 % av populationen. Sekret från övre luftvägar kan direkt eller indirekt överföra smitta mellan människor. Meningit uppstår oftast efter hematogen spridning från en primärinfektion (med eller utan symtom) i de övre luftvägarna. Patienter med tecken på både meningit och sepsis/bakteriemi är därför vanligt. Invasiv meningokocksjukdom är livshotande främst p g a den septiska chocken.

Klinik

Meningokocksjukdom i smittskyddslagens mening omfattar meningokockinfektion med akut hjärnhinneinflammation, sepsis, kronisk meningokockiemi samt andra invasiva infektionstillstånd med dokumenterad meningokock-etiologi. Bakterierna kan orsaka akut eller kronisk sjukdom, dvs akut hjärnhinneinflammation (meningit), sepsis, kronisk meningokockemi och i enstaka fall meningokockpneumoni eller infektion i annan lokal. Bakterien kan dock även förekomma i svalg och i nasofarynx hos i övrigt friska individer (asymptomatiska meningokock-bärare, se nedan).

Det är utomordentligt viktigt att personer med misstänkt meningit/sepsis snabbt kommer under rätt behandling, vilken inkluderar korrekt parenteralt antibiotikum. Snabb och optimal diagnostik och prompt information från laboratorium till behandlande läkare ingår som viktiga delar i handläggningen av dessa patienter. Meningiter kan leda till död genom t ex hjärnödem och nedsatt cirkulation till vitala delar av CNS, men ger oftare permanenta neurologiska och psykiska skador. Trots all till buds stående modern sjukvård har sjukdomen en mortalitet på upp till 10 %, vilket framförallt speglas av det mycket snabba sjukdomsförloppet.

Lokala infektioner i luftvägarna (sinuit, mediaotit, konjunktivit, faryngit, pneumoni) kan i låg frekvens tillskrivas meningokocker. Ögoninfektioner orsakade av meningokocker är sällsynta. Meningokockkonjunktivit kan dock förekomma isolerad eller i samband med annan meningokockinfektion. Den kliniska bilden påminner om gonokockkonjunktivit med akut purulent sekretion.

Epidemiologi

Antalet rapporterade fall av invasiv meningokockinfektion i Sverige är färre än 100 per år (huvudsakligen meningit och septikemi). Under 10-årsperioden 2002-2011 rapporterades mellan 47 och 68 fall/år. Vanligen en till två situationer per år hade möjlig koppling mellan fall. Frekvensen av asymptomatiska meningokock-bärare varierar med ålder, årstid och population. I en normalbefolkning kan den uppskattningsvis ligga mellan 10-30 %. Bärarfrekvensen av meningokocker som ger invasiv sjukdom är emellertid betydligt lägre i samhället och ligger runt 1 %.

Prevention

Skärpt uppmärksamhet påbjuds kring invasiva sjukdomsfall så att tidig och effektiv diagnostik och behandling kan utföras. Antibiotikaprofylax (kemoprofylax) övervägs till den närmaste familjen eller liknande, i samråd med smittskyddsläkare (se nedan). Vaccin som skyddar mot meningokock serogrupperna A, C, Y samt W-135 finns tillgängligt. Det är inte registrerat för mindre barn men kan ges till barn från 2 årsåldern. Det kan ges inför resa till områden med pågående epidemi eller vid ett utbrott av flera fall. I Sverige har tidigare år de flesta personer insjuknat av meningokocker serogrupp B, mot vilka det ännu inte finns något verksamt brett täckande vaccin men dylika vaccin är under utprövning. Sedan 2009 har antalet fall av grupperna C och Y ökat medan B minskat.

Provtagning

Vid misstanke om meningit bör prov från cerebrospinalvätska (Csv) för odlingsdiagnostik åtföljas av samtidig blododling för optimering av sensitivitet. Om lumbalpunktion ej kan utföras akut är det av allra högsta vikt att blododling utförs innan insatt antibiotikabehandling. Vid utredning av misstänkt meningokocksjukdom bör provtagningen alltid kompletteras med svalgodling avseende meningokocker. Prov tas då från tonsiller med provtagningsspinne och transporteras i kolat transportmedium (alternativt okolat transportmedium om kolad provtagningspinne användes). Frågeställning meningokocker måste framgå för svalgprovet och anges på remissen. Detta är inte nödvändigt för Csv- och blododlingsprov. Prov kan också vara aktuella från andra lokaler som bland annat nedre luftvägar och ledvätska.

Provtagning för utredning av MC-bärarskap, t ex familjemedlemmar till meningokocksjuk individ, utredning vid utbrott i skola, daghem, militärförläggning, bör endast göras på strikta kliniska och/eller epidemiologiska indikationer, i samråd med smittskyddsläkare. Utredning för ställningstagande till antibiotikaprofylax är ej tillräcklig indikation. Större odlingsutbyte har erhållits med svalg/tonsillprov än med nasofarynxprov vid utredning av MC-bärarskap. (Se vidare avsnitt Munhåla, svalg-provtagning och odling).

Utförande

Provtagning från Cvs beskrivs i artikeln CNS-infektioner-provtagning och transport
Provtagning för blododling beskrivs i artikeln Provtagning-blododling
Provtagning från svalg beskrivs i artikeln Munhåla, svalg-provtagning och odling
Prov från öga beskrivs i artikeln PROVTAGNING, ALLMÄNNA UTGÅNGSPUNKTER (ögoninfektioner).

Laboratoriediagnostik

Allmänt om CNS-diagnostik

Allmänt, meningokockinfektioner

Odling utgör referensmetodik för påvisande av meningokocker i alla typer av kliniska prov. Meningokocker kan påvisas i kliniska prover med mikroskopi, antigendeteiktion (Csv-prov), och nukleinsyrapåvsning (ett antal målsekvenser kan utnyttjas för PCR-diagnostik). Serologiska tester kan användas som ytterligare stöd i diagnostiken samt för konfirmering av immunitet efter vaccination.

Referensmetodik

Primärisolering

Odling av likvorprov beskrivs under Allmän bakteriologisk diagnostik.

Referensmedium: GC agarbas med hemoglobin, hästserum, IsoVitalex samt VCNT (Vankomycin, Kolistin, Nystatin, Trimetoprimlaktat). (Substratrecept se ÖLI-bilaga 9).

Utodling och inkubering: Prov för MC odlas ut på selektivt GC-medium och idealt även på ett icke-selektiv GC-medium. Agarplattorna inkuberas omgående i termostat, fuktig atmosfär, 36-37°C, med 4-6 % CO₂.

Avläsning, identifiering

Presumtiv diagnos

Avläsning sker efter 1 och 2 dygn. Misstänkta kolonier oxidasprövas. Omstickning och gramfärgning av oxidaspositiva kolonier. Ett representativt urval av 5-10 kolonier bör underkastas verifikationsprövning.

N. meningitidis växer fram relativt långsamt. I typiska fall tar det 12-24 timmar för kolonier att utvecklas på GC-mediet. De är ofärgade, klara till lätt opalescenta, kupolformade, med jämn kant och är varken nedvuxna i agarmediet eller förskjutbara mot detta. Konsistensen är lätt krämig (äldre kolonier kan ha en seg karaktär). Karaktäristisk lukt saknas (jämför Haemophilus influenzae) eller är så diskret (antydd fränhet) att den diagnostiska användbarheten är marginell. Kolonimorfologiskt liknar N. meningitidis och H. influenzae varandra vid tidig avläsning av odlat Csv-prov. Oxidastest på kolonimaterial ger en bra vägledning då N. meningitidis är snabbt och kraftigt oxidaspositiv, medan oxidasreaktionen för H. influenzae kommer med viss fördröjning. Mikroskopi av gramfärgat preparat bör dock alltid göras från framväxt bakterie innan en preliminär diagnos av N. meningitidis i ett Csv-prov sätts. N. lactamica ser ut som N. meningitidis men isoleras knappast från ett Csv-prov (publikationsfall) och diagnostiseras lätt med ONPG-test (positiv). Preliminärdiagnostiska krav är således växt av typiska, snabbt och kraftigt oxidaspositiva kolonier med karaktäristiska gramnegativa diplokocker vid mikroskopi. Verifierande speciesspecifik diagnostik utförs enligt nedan.

Slutlig verifiering

Minimikriterier för meningokocker är oxidaspositiva gramnegativa diplokocker som bryter ner glukos (dextros) och maltos, medan fruktos (syn. levulos) och laktos ej påverkas. Dessa test kan utföras efter tillväxt av bakterien på diagnostiska medier eller direkt på slammade bakterier från ett odlingsmedium. Kommersiellt tillgängliga test som API NH och RapID NH kan också användas. Se också artikel Maldi-Tof. Ibland kan nedbrytning av maltos och/eller glukos vara svår att påvisa, och en uppenbar risk finns för feldiagnostik gentemot N. gonorrhoeae och andra Neisseria species. Alternativt kan i sådana fall meningokocker verifieras med ytterligare fenotypiska (t.e.x. antigendetektion) eller genetiska metoder.

Övriga metoder

Direktmikroskopi av Csv-prov

I ett klassiskt fall ses typiska gramnegativa diplokocker såväl extra- som intracellulärt i polymorfkärninga leukocyter (PMNL). De ses vid mikroskopi oftast i par, med utseende som de två halvorna av en kaffeböna. Diploformerna kan hålla sig relativt intakta även efter fagocytos av leukocyter i Csv-prov. Vid ett kraftigt inflammatoriskt svar (dvs mycket PMNL och hög proteinkoncentration) kan det emellertid vara svårt att urskilja bakterierna. Akridinorangefärgning är därvid en stor tillgång och kan ersätta metylenblåfärgning för att leta efter bakterier och bedöma deras form. Observera att falskt negativ mikroskopi förekommer i 30-40 % och att falskt positiva resultat kan rapporteras om färgning och/eller mikroskopisk bedömning ej är optimal.

Direkt immunfluorescens är en relativt känslig metod (sensitivitet cirka 70 %) som kombinerar morfologi med specificitet. Bristen på kommersiellt tillgängliga bra konjugat gör att metoden kommit till liten användning.

Antigendetektion i Csv-prov

Förutom direkt immunfluorescens -test har bland andra följande metoder använts: motströmselektrofores, latex- och co-agglutinationstest samt ELISA.

Kommersiellt tillgängliga är latex- och co-agglutinationsreagens, som efter värmebehandling av Csv-prov kan påvisa koncentrationer över 10 $^4$ -10 $^5$ bakterier/mL inom ett par minuter. Sensitiviteten kan skattas ligga kring 60-70 %. Specificiteten är mycket hög förutsatt att kontroller används på ett korrekt sätt, så att fall med spontanagglutination kan upptäckas.

Nukleinsyrapåvisning i Csv-prov

För N. meningitidis har olika områden av genomet amplifierats med PCR-teknik i diagnostiska syften. Metoden kan vara mycket känslig och specifik, men val av målgen samt optimering och kvalitetssäkring av metoder för DNA isolering och PCR är mycket viktigt.

Övrig odling

Från misstänkt ingångsport dvs svalg (ange att N. meningitidis eftersöks på remissen eftersom provet även måste utodlas på selektivt medium (se referensmedium ovan) för att diagnostik skall ge ett meningsfullt resultat) och/eller annan lokal i de övre luftvägarna (t ex mellanöra, sinus, nasofarynx, konjunktiva);

blod x 2;
misstänkt septisk metastas (ledvätska, vätska från pleura, perikard etc).

Serologi

Serologisk undersökning av akut- och konvalescentserum med komplementbindningsreaktionen och ett batteri av värmebehandlade meningokocker kan i odlingsnegativa fall ge diagnosen N. meningitidis-infektion.

Epidemiologisk typning

Vid bakteriologiskt och kliniskt dokumenterad meningokocksjukdom samt vid utredning av misstänkt sådan, skall kompletterande serogruppering och genosubtypning alltid göras av isolerad stam. Detta kan primärt göras vid det lokala laboratoriet varefter stammen skickas till referenslaboratorium alternativt görs all typning på referenslaboratoriet. Vid meningokocksjukdom utförs denna typning utan kostnad för insändande laboratorium.

Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro, 701 85 Örebro, tel 019-602 1134 svarar för serogruppering, genosubtypning, utvidgat antibiogram och kan i speciella utredningar utöka karaktäriseringen.

Referensstammar

Adekvata referensstammar, beroende av frågeställning, kan erhållas från Nationella refereslaboratoriet for patogena Neisseria.

Svarsrutiner

“Växt av Neisseria meningitidis (serogrupp/genosubtyp)” för stam som uppvisar typisk morfologi, biokemi och serologi. Utvidgat antibiogram utsvaras även från referenslaboratoriet.

Gränsvärden inom SIR-systemet har fastslagits av RAF-M och EUCAST för N. meningitidis för antibiotika som är aktuella för behandling av patienter och bärare, samt för kemoprophylaxis. Test avseende beta-laktamas produktion bör ingå.

Laboratorierapportering

Följ länken till SoS falldefinition.

Isolat av N. meningitidis från i normala fall steril lokal anmäls av laboratoriet enligt smittskyddsförordningen (2004:255) anmälningspliktiga sjukdomar utöver allmänfarliga sjukdomar till Folkhälsomyndigheten och länets smittskyddsläkare. Isolerad invasiv stam skickas till Nationella referenslaboratoriet for patogena Neisseria för karaktärisering. Klinisk anmälningsplikt enligt smittskyddslagen föreligger för behandlande läkare.

Symtomfri bärare av meningokocker anmäls ej.

Referensfunktioner

Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Laboratoriemedicinska länskliniken, Universitetssjukhuset Örebro, 701 85 Örebro, tel 019-602 1134.

REFERENSER

Hughes JH, Biendenbach DJ, Erwin ME, Jones RN. E test as susceptibility test and epidemiological tool for evaluation of Neisseria meningitidis isolates. J Clin Microbiol 1993; 31:3255-3259.
Rådström P, Bäckman A, Qian N, Kragsbjerg P, Påhlson C, Olcén P. Detection of bacterial DNA in cerebrospinal fluid by an assay for simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and streptococci using a seminested PCR strategy. J Clin Microbiol 1994; 32:2738-2744.
Olcén P, Fredlund H. Isolation and characterization of Neisseria meningitidis in the vaccine era. Who needs what and when? Scand J Infect Dis 2010; 42:4-11.