Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik



Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)

NASBA Ă€r en av amplifieringsmetoderna som Ă€r baserade pĂ„ transkription (figur 17). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem Ă€r bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade pĂ„ denna process anvĂ€nds för detektion av Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycobacterium tuberculosis Gen-probe samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck frĂ„n högrisk HPV Norchip. Templatet Ă€r vanligtvis RNA och metoden baseras pĂ„ kopiering av RNA-mĂ„lsekvensen med hjĂ€lp av tre olika enzymer; reverse transkriptas, RNaseH och T7 DNA-beroende RNA-polymeras. Metoden Ă€r isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av mĂ„lsekvensen. MĂ„l-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som dĂ„ bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som dĂ„ innehĂ„ller endast cDNA. MĂ„nga RNA-kopior kan dĂ„ produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras frĂ„n detta cDNA. MĂ„lsekvensen detekteras med en probe inmĂ€rkt med en fluorofor och en slĂ€ckare/quencher, en molecular beacon probe (se Realtids-PCR). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescenslĂ€sare och analyseras. Risken för kontamination Ă€r mindre med system baserade pĂ„ RNA-kopiering Ă€n DNA-kopiering, dĂ„ RNA kopiorna som produceras inte Ă€r lika stabila som amplifierat DNA.


Figur 17. NASBA reaktionen. Bild; Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip, [1]

NASBA reaktionen startar dĂ„ primern (P1) hybridiserar till mĂ„l-RNAt. Primern innehĂ„ller en 5’-terminal T7 RNA polymeras promotor sekvens. Reverse transkriptas förlĂ€nger primern, bildar en cDNA-kopia av RNA-templatet som sedan formar en DNA/RNA-hybrid.
RNase H kÀnner igen hybriden som substrat och hydrolyserar, bryter ned, RNA-delen av hybriden vilket resulterar i enkelstrÀngat DNA. Den andra primern (P2) binder till detta DNA. Reverse transkriptas (RT) förlÀnger primer P2 vilket gör promotorregionen pÄ DNA-molekylen dubbelstrÀngad och transkriptionellt aktivt.
RNA polymeras kÀnner igen den nu funktionella promotorn och startar produktionen av stora mÀngder RNA transkript som Àr antisense mot den ursprungliga mÄl-RNA-sekvensen.