Odling och nukleinsyrapÄvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad april 2012.


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar


Odling och nukleinsyrapÄvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov

Riskklass 3-bakterier, i första hand Mycobacterium tuberculosis, kan diagnosticeras i sÀrskilt utrustade laboratorier. I Sverige finns sÄdana tillgÀngliga vid FolkhÀlsomyndigheten, universitetssjukhusen och ett fÄtal övriga lÀnslasarett. Dessa laboratorieenheter har sÀrskilt tillstÄnd för diagnostik med exempelvis odling och pÄvisande av nukleinsyra för nÄgon eller nÄgra av organismerna. Rutinerna och vilka organismer som hanteras varierar mellan laboratorierna.

Nedan följer en beskrivning över den diagnostik av riskklass 3-bakterier (utom Mycobacterium tuberculosis dÀr diagnostiken i landet beskrivs i separata artiklar) som erbjuds vid FolkhÀlsomyndigheten.

Bakgrund

Inom ramen för ett samarbete mellan SMI, SVA, FOI och Livsmedelsverket lades Är 2007 grunden för nÀtverket Forum för beredskapsdiagnostik (FBD). Det lÄngsiktiga mÄlet med nÀtverket Àr att skapa och förbÀttra förutsÀttningar för ett effektivt utnyttjande av landets kapacitet och kompetens för kvalitetssÀkrad och uthÄllig diagnostik av riskgrupp 3-agens i första hand vid utbrottssituationer, men ocksÄ vid frÄgestÀllningar rörande enskilda sjukdomsfall. Detta nÄs med utvecklandet av harmoniserade och kvalitetssÀkrade myndighetsgemensamma detektionsmetoder enligt sÀrskild lista som grundar sig pÄ nationella och internationella risk- och sÄrbarhetsanalyser. Fram till 2011 har man bland annat gemensamt utvÀrderat av automatiserad utrustning för extraktion av DNA i BSL3-laboratorium och utvecklat molekylÀrbiologisk diagnostik av Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei och Coxiella. Man har Àven harmoniserat odlingsmetodik för ovannÀmnda agens.

FolkhÀlsomyndigheten utför i dag diagnostik pÄ sÀkerhetslaboratoriet med realtids PCR av dessa bakterier och Brucella species i humana prov . Arbete pÄgÄr med att utöka den diagnostiska verksamheten inom ramen för samarbetet.

Indikation

Diagnostik i sÀkerhetslaboratoriet vid FolkhÀlsomyndigheten av riskgrupp 3-bakterier (Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei, Brucella species och Coxiella).

Kliniska prover med sÄdana frÄgestÀllningar bör skickas till FolkhÀlsomyndigheten för hantering (blod, benmÀrg, sÄrsekret, annat). I de fall det rör sig om blododlingar (ofta Brucella eller Francisella) kan de inkuberas pÄ det lokala laboratoriet, och, utan att den först öppnas, skickas till FolkhÀlsomyndigheten om indikation pÄ vÀxt föreligger. Det förekommer inte sÀllan att riskgrupp 3-bakterier inte primÀrt misstÀnkts, varvid positiva blododlingar redan hanterats pÄ laboratoriet för framstÀllning av grampreparat, utodling pÄ agarplattor etcetera. SÄ snart misstanke dÄ uppstÄr skall positiva flaskor och eventuellt utvÀxta plattor (se nedan under provmaterial) skickas till FolkhÀlsomyndigheten för diagnostik. Se ocksÄ artikel OmhÀndertagande av kliniska prov samt framodlade mikroorganismer med sÀrskild hÀnsyn till förekomst av riskklass 3 och 4 patogener.

Diagnostik av riskgrupp 3-bakterier kan Àven utföras vid FolkhÀlsomyndigheten vid misstanke om avsiktlig spridning av smittÀmne (exempelvis vid bioterrorism).

Provmaterial

Blod eller benmÀrg i aerob blododlingsflaska. Koagulerad benmÀrg eller blod Àr inte lÀmpliga för diagnostik, eftersom de mÄste mortlas före hantering med risk för kontamination. De kan ÀndÄ tas emot. Andra typer av prov Àr aspirat frÄn abscess, lymfkörtel eller pinnprov. Plattor med utvÀxta kolonier kan ocksÄ skickas. Det senare bör om möjligt undvikas, men det Àr bÀttre att skicka plattan Àn att sticka om.

Provtransport

Provmaterial förpackas enligt Packa provet rÀtt som biologiskt Àmne kategori B.

GÀllande transportföreskrifter, se Packa Provet RÀtt.

Provhantering pÄ FolkhÀlsomyndigheten

All provhantering sker i sÀkerhetslaboratoriet. Observera att endast efterfrÄgad organism primÀrt diagnosticeras. Enligt önskemÄl frÄn avsÀndare kan ytterligare diagnostik utföras (direkt-PCR pÄ annan P3-organism, artbestÀmning med sekvensering av 16s rDNA, i begrÀnsad omfattning fenotypisk diagnostik av stafylokocker). Den diagnostiska kapaciteten har nu utvidgats till att omfatta Àven Maldi-Tof masspektrometri.

Blododlingsflaska

  • Vid ankomst: NĂ„gra droppar av innehĂ„llet appliceras och sprids pĂ„ blodagar och hematinagar. Plattorna inkuberas i 36+-1 °C i luft eller CO2 och avlĂ€ses efter 1, 2, 3 och 7 dagar beroende pĂ„ vilket/vilka agens som efterfrĂ„gas.

Realtids-PCR frÄn flaskinnehÄll görs direkt vid ankomsten enligt sÀrskild rutin mot efterfrÄgad organism.

PreliminÀrt provsvar (telefonsvar) lÀmnas till avsÀndare om provet blir positivt i direkt realtids-PCR.

Om direkt realtids-PCR blir negativ görs om avsÀndaren sÄ önskar pÄ samma templat direkt realtids-PCR för annan P3-organism eller artbestÀmning genom sekvensering av 16s rDNA.

  • Blododlingsflaskan inkuberas upp till 4 veckor (gĂ€ller Brucella) i 36+-1 °C varefter realtids-PCR körs frĂ„n flaskan om diagnos inte tidigare stĂ€llts.

Provet slutsvaras dÀrefter.

Flytande prover (CSF, aspirat, och dylikt)

  • Vid ankomst: Om möjligt odlas provet pĂ„ blodagar och hematinagar.

Direkt realtids-PCR enligt rutiner för blododlingsflaska.

  • Hanteras och slutsvaras vidare som ovan för blododlingsflaska.

Pinnprover

  • Vid ankomst: Provet odlas pĂ„ blodagar och hematinagar. Övrig hantering enligt nedan under Kolonier pĂ„ agarplatta.

Kolonier pÄ agarplatta

  • Vid vĂ€xt av blandkultur görs omstrykning pĂ„ blodagar och hematinagar.
  • Vid vĂ€xt av renkultur görs gramfĂ€rgning och direkt realtids-PCR med ledning av primĂ€rt fynd.

Prover som mortlas (körtlar, benmÀrg, koagulerat blod)

  • Vid ankomst: Vid behov sönderdelas provet med skalpell före mortling och mortlas i lĂ€mplig mĂ€ngd PBS. Det mortlade materialet utodlas pĂ„ blodagar och hematinagar och direkt realtids-PCR, varefter resterande material tillsĂ€tts en aerob blododlingsflaska.

Svarsrutiner

PreliminÀrsvar frÄn PCR-analys direkt frÄn exempelvis blododlingsflaska svaras normalt sett ut inom ett par timmar efter att provet mottagits vid FolkhÀlsomyndigheten. Om ingen vÀxt noterats under observationstiden besvaras provet: Ingen vÀxt av efterfrÄgad organism. Om vÀxt besvaras provet med vÀxt av efterfrÄgad organism samt resultat av direkt realtids-PCR, eventuell resistensbestÀmning om det Àr begÀrt.

Addendum (Realtids-PCR-pÄvisning av P3-bakterier)

FolkhÀlsomyndighetens realtids PCR mot P3-organismerna utförs pÄ DNA som extraheras enligt sÀrskilda rutiner pÄ sÀkerhetslaboratoriet.

Med PCR-teknik amplifieras specifika nukleinsyrafragment (DNA-fragment) i nÀrvaro av en fluorescerande TaqMan-probe som Àr specifik för respektive mÄlsekvens. Extraherat templat i det okÀnda provet identifieras genom pÄvisande av PCR-produkten i form av ett ct-vÀrde. Inför PCR-analysen extraheras DNA frÄn de kliniska provmaterialen. SÀlherpes (PhHV-1) tillsÀtts varje patientprov (spikning), som extraktions-och inhibitionskontroll. För varje PCR körs alltid en positiv och en negativ kontroll.

  • Brucella identifieras genom pĂ„visande av en genusspecifik insertionssekvens IS711 som förekommer i varierande antal, men alltid i samma antal inom varje species. Den pĂ„ FolkhĂ€lsomyndigheten anvĂ€nda PCR-metoden pĂ„visar Brucella till genusnivĂ„. Diagnostiken kompletteras med samtidig identifiering av B. abortus med pĂ„visande av BruAB2_0168 och 16S rDNA (den senare för rutinpĂ„visande av bakteriellt DNA).
  • Francisella tularensis pĂ„visas med amplifiering av insertionssekvensen ISFtu2. MĂ„lsekvenser som tillĂ„ter sĂ€rskiljandet av typ A och B anvĂ€nds ocksĂ„ (Ftt0524 kodar för ett speciesspecifikt protein med okĂ€nd funktion. F. tularensis typ B kan specifikt pĂ„visas med amplifiering av junction ISFtu2-3ÂŽreg). Genusspecifika tul4 Ă€r en gen som kodar för yttre membranproteiner.
  • Bacillus anthracis pĂ„visas med amplifiering av en för organismen specifik beta-subenhet pĂ„ RNA-polymerasgenen (rpoB), tillsammans med en kromosomal markör (BA5345) och de tvĂ„ virulensplasmiderna pX01-pag A (svarar bland annat för toxinproduktion) och pX02-capD (kapselprotein). För diagnosen krĂ€vs att bĂ„da virulensplasmiderna pĂ„visas. Bakterierna attenueras om en av plasmiderna saknas.
  • Yersinia pestis pĂ„visas genom amplifiering av pPCP1-PLA och den för arten specifika pMT1-caf1 som uttrycks i tvĂ„ virulensplasmider med endast delvis klarlagda funktioner. Inv-genen Ă€r praktiskt taget identisk med motsvarande gen hos Y. pseudotuberculosis. YPO1091 kodar för ett profagprotein hos Y. pestis.
  • Burkholderia mallei och pseudomallei pĂ„visas genom amplifiering av en genusspecifik region inom FliC-genen som kodar för flagellin. En för B. mallei specifik genregion FliP-IS407A och en för B. pseudomallei specifik gen för ett metalloproteas (mprA) amplifieras för att skilja de tvĂ„ arterna.
  • Coxiella burnetii pĂ„visas genom amplifiering av artspecifik insertionssekvens IS1111a.

Uppgifter om primer-och probesekvenser kan pÄ sÀrskild begÀran tillhandahÄllas av FolkhÀlsomyndigheten.

REFERENSER