Odling och substrat-svamp

Hoppa till: navigering, sök

Artikeln reviderad maj 2010


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner



Odling och substrat

Liksom vid bakterieodling gÀller att provet tas adekvat och transporteras snabbt till laboratoriet under förhindrande av uttorkning. DÄ antalet svampenheter, som vÀxer ut som kolonier, brukar vara mindre Àn bakterieantalet vid motsvarande infektion Àr kvantiteten provmaterial viktig. Vid flytande prov bör cellerna koncentreras genom centrifugering. Angivna substrat finns beskrivna i bilaga 3 och kontrollstammar i bilaga 4.


Medier för primÀrisolering

De flesta svampar vÀxer pÄ tÀmligen okomplicerade medier liksom pÄ vanliga substrat för primÀrisolering av bakterier. Ett vÀlbeprövat svampsubstrat Àr Sabouraudagar (bilaga 3), som Àr ett enkelt glukos- och peptonsubstrat med pH 5,6. Ett mÄttligt surt pH gynnar de flesta svampar gentemot bakterier. Vissa svampar, t.ex. Candida glabrata, krÀver ett lÄgt pH för att vÀxa ut. För att hindra vÀxt av bakterier brukar vanligtvis Àven antibiotika tillsÀttas. För att hindra vÀxt av mögel vid primÀrodling av dermatofyter tillsÀtts cykloheximid (Actidion, toxiskt), vanligtvis i en koncentration pÄ 0,5 g/L. Emellertid hÀmmas ocksÄ mÄnga opportunistiska patogener som t.ex. vissa Candida-arter av cykloheximid varför ett medium fritt frÄn sÄdant bör inkluderas. Dermatofyter och C. albicans hÀmmas dock ej.

BHI-agar (Brain Heart Infusion) Àr ett rikt medium, som framför allt kommer till anvÀndning vid odling av jÀstfasen av de geografiskt endemiska dimorfa patogenerna (bilaga 3).

CHROMagar anvÀnds för primÀrisolering och presumtiv identifiering av olika jÀstsvamparter (bilaga 3). Olika jÀstpopulationer differentieras genom kolonimorfologi och fÀrg. HÀrigenom underlÀttas ocksÄ identifieringen av svamp i blandkulturer vilket har blivit sÀrskilt intressant genom att C. krusei och C. glabrata har naturligt nedsatt kÀnslighet mot flukonazol.

För primÀrkulturer och isolering kan agar gjutas i 9 cm petriskÄlar, gÀrna 40 mL per skÄl, för att hindra uttorkning. Om man har mÄnga petriskÄlar i termostatskÄpet eller inkuberar vid lÀgre temperatur brukar inte uttorkningen vara nÄgot problem. Vid odling över 3 veckor rekommenderas snedagarrör med plasthatt som ej fÄr sluta för tÀtt. Om man önskar bevara en kultur Àr det bÀttre att odla i ett skruvlocksförsett rör. Man bör dock komma ihÄg att under svampens utvÀxt skruvlocket bör vara lÀttat för att tillÄta tillgÄng pÄ syrgas.

Medier

  • Standardsubstrat för utvĂ€rtes prov (dermatofyter och andra utvĂ€rtes förekommande svampar):
    • -Sabouraudagar utan cykloheximid med antibiotika (bilaga 3)
    • -Dermatofyt test medium (DTM) med cycloheximid, antibiotika, indikator (bilaga 3)
    • -Mycobioticagar med cykloheximid + antibiotika (bilaga 3)
    • -se sĂ€rskilt tillvĂ€gagĂ„ngssĂ€tt för Malassezia,
  • Standardsubstrat för invĂ€rtes prov (jĂ€stsvampar och andra invĂ€rtes förekommande svampar):
    • -Sabouraudagar med antibiotika (bilaga 3)
    • -Glukosblodagar med antibiotika (bilaga 3)
    • -CHROMagar (olika kommersiella alternativ finns)
    • -Brain Heart Infusion (BHI)-agar (bilaga 3) som tillĂ€gg vid odling av vĂ€vnadsbitar och vid djup och endemisk mykos

Inkubering

Temperatur: Svampodlingar frÄn alla typer av prov inkuberas rutinmÀssigt vid 30 °C. InvÀrtesprov odlas dÀrutöver vid 37 °C. Optimal temperatur för inkubering av dermatofytodlingar Àr 28-32 °C. Av mögel vÀxer A. fumigatus och patogena zygomyceter vid sÄvÀl 30 °C som vid 37 °C och 42 °C.

Malassezia-arter vÀxer bÀst vid 30-35 °C. C. neoformans vÀxer optimalt vid 30 °C men vÀxer vanligen Àven vid 37 °C i motsats till övriga Cryptococcus spp. Dimorfa svampar vÀxer i mögelfas vid 20-30 °C och i jÀstfas vid 37 °C. CHROMagar skall inkuberas i 37 °C.

Tid

JĂ€stsvamp 1 vecka.

MisstÀnkt mögel 1-2 veckor.

För hÄr/hud Àr rutinmÀssig inkubationstid 3 veckor.


Malassezia-arter vÀxer ofta fram efter 2-4 dagar men kulturerna bör inkuberas minst 7 dagar.

Likvor bör inkuberas 3-4 veckor Àven om majoriteten kryptokocker vÀxer fram pÄ nÄgra dagar.


Rekommendationen kan ocksÄ utformas sÄ att

  • 1) invĂ€rtesodlingar lĂ€ses efter 1-2 dagar och slutavlĂ€ses efter ca 1 vecka, vid mögelmisstanke förlĂ€ngt till 2 veckor och vid endemiska mykoser till 4 veckor,
  • 2) utvĂ€rtesodlingar lĂ€ses av efter en vecka och dĂ€refter en - tvĂ„ gĂ„nger i veckan. SlutavlĂ€sning efter 3-4 veckor.


Hud, hÄr och naglar

Material frÄn dessa keratinhaltiga vÀvnader odlas enligt ovan. DTM-agar Àr ett selektiv- och indikatormedium för pÄvisande av dermatofyter (bilaga 3). Detta medium innehÄller som pH-indikator fenolrött, vilket gör, att mediet blir rödfÀrgat omkring den begynnande dermatofytvÀxten pÄ grund av snabb alkalisk reaktion, vilket Àr nÀstan specifikt för dermatofyter.

Omslag kan emellertid ocksÄ ske vid vÀxt av andra svampar t ex Chrysosporium-arter men framtrÀder dÄ ej förrÀn kolonin Àr utvÀxt och dÄ oftast med svagare rödfÀrgning. Hudskrap fördelas jÀmnt över agarytan. Vanligen anvÀnds en plast- eller platinanÄl som fuktats pÄ agarmediet, vilket gör att hudflagorna fastnar pÄ nÄlen och lÀtt kan överföras. Eftersom förekomsten av viabla dermatofytelement ofta Àr sparsam, Àr det viktigt att överföra sÄ mycket som möjligt av provmaterialet.

HÄr taget de första 6-7 mm frÄn hÄrroten överförs till agarytan.

Nagelmaterial skrapas och sönderdelas i smÄ fragment vid provtagningen, varvid man i synnerhet tar tillvara sköra och missfÀrgade delar.

Om prov tagits frÄn epidermis med tejp överförs denna till agarytan (förslagsvis Sabouraud) och inkuberas tre dagar vid 30°C, varefter den avlÀgsnas.

De vanligaste patogena isolaten Àr för

  • hud: Candida, Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum, Malassezia.
  • hĂ„r: Trichophyton, Microsporum.
  • nagel: Trichophyton, Candida (sĂ€rskilt C. parapsilosis och C. albicans), Epidermophyton, Trichosporon, Scopulariopsis och Scytalidium (syn. Hendersonula).
  • öga: Candida, Aspergillus, Fusarium, Acremonium.
  • öra: Aspergillus, Candida, Scedosporium.


Odlingsteknik för Malassezia

Eftersom Malassezia-arter Àr lipofila behövs tillsats av lipider till odlingsmediet för vÀxt. DÀrför rekommenderas odling pÄ Dixon eller Leeming and Notman (LNA) agar. Odlingsplattan inkuberas vid 30 °C i plastpÄse 7-10 dagar. Vanligen vÀxer kolonierna fram efter 2-4 dagar.


Odling frÄn provtagningspinnar

Provtagning med pinne görs ofta frÄn munhÄla, nÀsa, nasofarynx, öga, vagina, uretra, sÄr, öra och hörselgÄng. Utodlingen Àr likartad som för bakterier.

Provpinnen stryks ut över agarytan och plattorna/rören inkuberas vid 30 och Àven vid 37 °C för snabbare utvÀxt.

De flesta jÀstsvampar vÀxer ut inom 48 tim. Mögel och andra trÄdbildande svampar frÄn t.ex. sÄr och yttre hörselgÄng kan krÀva upp till en vecka. De vanligaste isolaten Àr Candida och Aspergillus.

Blododling

Blododling Àr en relativt okÀnslig metod för att pÄvisa invasiv svampinfektion, i synnerhet sÄdana orsakade av trÄdsvampar. Det lÄga utbytet vid blododlingar kan bero pÄ att antalet svampar i blodet vanligen Àr ytterst lÄgt. En del av de förökningsbara svamparna, företrÀdesvis jÀstceller, förekommer intracellulÀrt. Val av blododlingsmetod spelar dÀrför stor roll för utbytet. Frekvensen invasiva svampinfektioner har ökat under senare Är.

Blododlingsrutinerna för svamp följer i stor utstrÀckning dem för bakterier. Viktigt Àr att man tar en rekommenderad blodvolym, 8-10 mL per flaska. Bactec rekommenderar sÀrskild svampflaska medan BacTAlert anvÀnder samma som för bakterier. Internationellt rekommenderas fem dagars inkubationstid, vilken ev. kan förlÀngas till tio dagar vid svampmisstanke, eftersom det Àr kÀnt att Histoplasma capsulatum vÀxer lÄngsamt, och vissa Cryptococcus neoformans-stammar kan ge svaga signaler.

I alla blododlingssystem tar det lÀngre tid för svamparna att vÀxa ut Àn för bakterier. Tiden för de vanligaste Candida-arterna tycks ligga mellan 1-2 dygn för de snabbaste systemen.

Det Àr en allmÀn erfarenhet, att invasiva svampinfektioner orsakade av Aspergillus ger inte positiva fynd vid blododlingar, sannolikt beroende pÄ att mögeltrÄdarna vÀvs in i vÀvnadsstrukturen och fÄ viabla svampelement lossnar och sprids med blodbanan. Situationen Àr dock annorlunda för Fusarium (ovanlig vid invasiv infektion), som ger positiva blododlingar och multipla septiska metastaser, bl.a. petekiala hudlesioner som tillvÀxer.