PAR 01 Cystor och maskÀgg, feceskoncentration

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel, publicerad februari 2012.


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik och Tarminfektioner



Mikroskopisk pÄvisning av cystor och maskÀgg efter formalin/etylacetat koncentration av feces

Analysprincip

Formalinfixerad feces filtreras, skakas med etylacetat och centrifugeras för att separera maskÀgg, larver, cystor och oocystor frÄn fett och skrÀp. Efter centrifugering bildas fyra skikt: i botten av röret ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg med skrÀp och överst en etylacetatfas. Sedimentet granskas i ljusmikroskop. Materialet i sedimentet kan Àven anvÀndas till olika specialfÀrgningar för att identifiera specifika parasiter. Observera att metoden inte rekommenderas för pÄvisning av trofozoiter i feces, Screening av trofozoiter görs istÀllet innan koncentrering, d .v. s. direkt efter filtrering. Trofozoit-screening förutsÀtter att provet bestÄr av SAF-fixerad feces. För verifierande fÀrgningsmetod se metodbeskrivning PAR 03 .

Speciell utrustning

Ljusmikroskop objektiv 10x, 20/25x, 40x samt med kalibrerat mÀtkular

Reagenser

  • formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin)
  • etylacetat C4H8O2 p.a.
  • D'Antonis jodlösning (ref. 1)
Lös 1,0 g kaliumjodid och 1,5 g jodkristaller i 100 mL destillerat vatten.
AnvÀnd magnetomrörare. En del kristaller förblir olösta. Förvaras i mörk flaska. Filtreras innan anvÀndning.
  • natriumklorid 0,9 %

Analysprocedur

1. Blanda en sked (ca 1 gram) feces med 7 mL 3,7 % formaldehyd i ett mĂ€rkt rör. (Observera att detta moment redan Ă€r utfört pĂ„ de prov som sĂ€nts in i formaldehyd eller SAF-fixativ (anmĂ€rkning 1). Blanda provet noggrant med ett par trĂ€pinnar.

2. LÄt stÄ 30 min för fixering och inaktivering.

3. En lagom mÀngd fecesblandning (beroende pÄ provets tjocklek) filtreras genom fuktad gasvÀv lagt över en plastbÀgare (anmÀrkning 2). OBS! Om provet Àr mycket tunt eller mest bestÄr av slem fortsÀtt direkt till punkt 7 (anmÀrkning 3).

4. Kontrollera om det finns maskar eller maskdelar i gasvÀven.

5. HÀll över filtratet i ett mÀrkt centrifugrör. Justera volymen med formalin till 7 mL.

6. TillsÀtt 3 mL etylacetat och sÀtt pÄ locket (skruvlock eller propp). Skaka 15 sek med skakapparat alternativt 30 sek för hand.

7. Centrifugera i minst 1000 x g under 2–3 min. BehĂ„ll locket pĂ„. Centrifugera 5 min om Cryptosporidium-undersökning Ă€r begĂ€rd (anmĂ€rkning 4).

8. Röret innehÄller nu fyra skikt. I botten ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg och överst en etylacetatfas.

9. HÄll röret med botten snett uppÄt och lossa försiktigt fettpluggen med en trÀpinne och hÀll av allt utom sedimentet (anmÀrkning 5). HÀll avfallet i lÀmpligt kÀrl.

10. BehÄll röret i samma position och torka av insidan med en bomullspinne. PÄ detta sÀtt undviker man att fÄ rester av etylacetat i sedimentet.

11. SĂ€tt vid behov till ett par droppar 0,9 % NaCl till bottensatsen.

12. LÄt röret stÄ i dragskÄp tills etylacetaten har avdunstat innan avlÀsning.

AnmÀrkning

1. SAF-fixativ Àr ett transportmedium och enligt publicerade rekommendationer skall det filtrerade provet först tvÀttas med NaCl. För fortsatt koncentrering rekommenderas formalin eller NaCl (ref 4 och 5). 2. OvanstÄende analysprocedur kan anpassas enligt lokala behov. T. ex kan gasvÀven lÀggas i en tratt och provet filtreras direkt i röret.

3. Mycket tunna och/eller slemmiga prov tappar det mesta av sitt material vid ovanstÄende koncentrations-förfarande. SÄdana prov centrifugeras direkt efter formalinfixering utan vare sig filtrering eller skakning med etylacetat.

4. Föreslagna centrifugeringstider och g-tal varierar mycket mellan olika publikationer. För koncentration av Cryptosporidium-oocystor rekommenderas lĂ€ngre centrifugeringstid (5–10 min) Ă€n för cystor och maskĂ€gg (2–3 min).

5. Om bottensatsen Ă€r för tjock – tag mindre mĂ€ngd fecesblandning under punkt 3 ovan.

AvlÀsning

Blanda sedimentet. MÀrk ett objektglas med provnummer och lÀgg upp tvÄ preparat frÄn varje prov. OBS! Om frÄgestÀllningen avser trematodÀgg granskas hela sedimentet. Det ena preparatet blandas med en droppe jodlösning innan tÀckglas lÀggs pÄ. Granska systematiskt hela det ofÀrgade preparatet med 10x objektiv eller med högre förstoring om sÄ behövs. Det jodfÀrgade preparatet granskas med 20x objektiv eller högre. MaskÀgg syns i regel bra med 10x objektiv och utan jodfÀrgning, medan cystor lÀttare upptÀcks och identifieras vid högre förstoring och med jodfÀrgning. AnvÀnd mÀtokular nÀr sÄ krÀvs. Cryptosporidium-oocystor kan ibland upptÀckas vid direkt-mikroskopi av sediment frÄn koncentrationsmetoden. För konfirmering krÀvs fÀrgning med specifik metod. Se metodbeskrivning Ziehl-Neelsen fÀrgning PAR 02. För morfologiska kriterier hÀnvisas till respektive parasitavsnitt.

Svarsrutiner

Negativa prov: Inga cystor eller maskÀgg pÄvisade

Positiva prov: Utsvar skall innehÄlla information om utvecklingsstadium och om möjligt bÄde genus och species. Exempel positivt prov: Cystor av Giardia intestinalis pÄvisade

KvalitetssÀkring

Intern

En panel med prov innehÄllande alla vanligt förekommande fecesparasiter rekommenderas för intern kvalitetssÀkring. För lÀmpligt bildmaterial se referens 6 och 7.

Extern

Cystor, oocystor och maskÀgg ingÄr i UK-NEQAS feces-utskick.

Referenser

1. D'Antoni, Joseph S. Standardization of the Iodine Stain for Wet Preparations of Intestinal Protozoa Am J Trop Med 1937, 1-17: 79-84.

2. Allen A V H, Ridley D D. Further observations on the formol-ether concentration technique for faecal parasites. J Clin Path 1970; 23:545-46.

3. Young K H, Bullock S L, Melvin D M, Sprull C L. Ethyl acetate as a substitute for diethyl ether in the Formalin-ether sedimentation technique. J Clin Microbiol 1979; 10:852-3.

4. Utzinger J, Botero-Kleiven S, Castelli F, Chiodini PL, Edwards H, Köhler N, Gulletta M, Lebbad M, Manser M, Matthys B, N'Goran EK, Tannich E, Vounatsou P, Marti H. Microscopic diagnosis of sodium acetate-acetic acid-formalin-fixed stool samples for helminths and intestinal protozoa: a comparison among European reference laboratories. Clin Microbiol Infect. 2010 Mar;16(3):267-73.

5. Yang J, Scholten T. A fixative for intestinal parasites permitting the use of concentration and permanent staining procedures. Am J Clin Pathol. 1977 Mar;67(3):300-4.

6. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 1-9

7. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.