PAR 10 Odling av Acanthamoeba

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel, publicerad mars 2012.


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik


Odling av Acanthamoeba pÄ non-nutrient agar

Analysprincip

Anrikning av Acanthamoeba frÄn patientprov genom odling pÄ non-nutrient agarplatta tÀckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas sÄ smÄningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.

Reagenser

PageŽs saltlösning, steril

Lösning 1

Na2HPO4 2.84 g
KH2PO4 2.72 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ÂșC

Lösning 2

MgSO4 7H2O 8.0 g
CaCl2 2 H2O 8.0 g
NaCl 0. 240 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ÂșC. LĂ„t kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
Förvaring: kylskÄp

Blodagar plattor

Förvaring: kylskÄp
HĂ„llbarhet: ca 4 veckor

E. coli K12 kultur

Förvaring: kylskÄp
HĂ„llbarhet: ca 4 veckor

Non-nutrient agar i rör, steril

agar utan tillsatser 15g
destillerat vatten, eller PBS eller PageŽs saltlösning 1 000 ml
Autoklavera, 20 min, 121 ÂșC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)

Positiv kontroll: Acanthamoeba spp. kultur.

Förvaring: kylskÄp
HÄllbarhet: flera mÄnader, sÄ lÀnge agarn ej Àr intorkad.

Analysprocedur

Arbetet utförs i sÀkerhetsbÀnk. Handskar anvÀnds genomgÄende.

Förberedelser

A. Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, Àldre bakterier fungerar ocksÄ).

  1. Stryk ut E. coli K12 pÄ en ny blodagar platta.
  2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.

B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förvÀg)

  1. BerÀkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta ÄtgÄr ett rör med non-nutrient agar.
  2. SmÀlt non-nutrient agar i kokande vattenbad.
  3. HÀll den smÀlta agarn i en petriskÄl och lÄt den stelna.
  4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskÄp.
  5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en mÄnad.

Analysdag

1. Rumstemperera agarplattorna

2. HÀll ca 0,5 mL PageŽs saltlösning pÄ blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 ”L bakteriologisk ögla. TillsÀtt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt pÄ varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 ”L bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret fÄr inte vara flytande (lÄt överflödig vÀtska absorberas in i plattan).

3. MÀrk plattorna med analysdatum och provnummer. MÀrk ocksÄ en platta för positiv kontroll och sÀtt undan till punkt 8.

4. LÀgg provmaterial pÄ plattan:

  • LinsvĂ€tska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras pĂ„ plattan.
  • Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. VĂ€vnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vĂ€tska!
  • Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.

5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpÄse med en liten bit fuktad pappershandduk).

6. TvĂ€tta arbetsytan med 70 % sprit.

7. Byt handskar.

8. SkÀr en ca 1 cm2 stor agarbit frÄn platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan mÀrkt positiv kontroll.

9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.

10. Inkubera alla plattor i en vecka.

AvlÀsning och bedömning.

Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avlÀsning med patientprov, tvÀtta dÀrefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. LÄt preparaten lufttorka. För fÀrgning med Giemsa se bilaga PAR 09 .

Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.

Trofozoiter kan variera mellan 20–40 ”m i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gĂ„nger per minut. Cystorna, 12–18 ”m i diameter, Ă€r polygonala, har dubbla vĂ€ggar och ser ut som kristaller. GiemsafĂ€rgning: Cytoplasman i fĂ€rgade trofozoiter innehĂ„ller flera vakuoler och har en centralt placerad kĂ€rna med en stor endosom (ref. 3).

Svarsrutin

VÀxt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. pÄvisade i odling.

Ingen vÀxt av Acanthamoeba spp. i odling.

KvalitetssÀkring

Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas

Prestanda

Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: Ă€r i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fĂ„s vid odling av djup biopsi frĂ„n hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk pĂ„visning kan endast genus anges.

SĂ€kerhetsaspekter och avfallshantering

Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. BĂ„de cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för mĂ€nniskor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.

Referenser

  • Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
  • Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
  • Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.