PAR 10 Odling av Acanthamoeba
Huvudartikel, publicerad mars 2012.
Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik
Odling av Acanthamoeba pÄ non-nutrient agar
Analysprincip
Anrikning av Acanthamoeba frÄn patientprov genom odling pÄ non-nutrient agarplatta tÀckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas sÄ smÄningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.
Reagenser
PageŽs saltlösning, steril
Lösning 1
- Na2HPO4 2.84 g
- KH2PO4 2.72 g
- destillerat vatten 500 ml
- Autoklavera, 20 min, 121ÂșC
Lösning 2
- MgSO4 7H2O 8.0 g
- CaCl2 2 H2O 8.0 g
- NaCl 0. 240 g
- destillerat vatten 500 ml
- Autoklavera, 20 min, 121ÂșC. LĂ„t kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
- Förvaring: kylskÄp
Blodagar plattor
- Förvaring: kylskÄp
- HÄllbarhet: ca 4 veckor
E. coli K12 kultur
- Förvaring: kylskÄp
- HÄllbarhet: ca 4 veckor
Non-nutrient agar i rör, steril
- agar utan tillsatser 15g
- destillerat vatten, eller PBS eller PageŽs saltlösning 1 000 ml
- Autoklavera, 20 min, 121 ÂșC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)
Positiv kontroll: Acanthamoeba spp. kultur.
- Förvaring: kylskÄp
- HÄllbarhet: flera mÄnader, sÄ lÀnge agarn ej Àr intorkad.
Analysprocedur
Arbetet utförs i sÀkerhetsbÀnk. Handskar anvÀnds genomgÄende.
Förberedelser
A. Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, Àldre bakterier fungerar ocksÄ).
- Stryk ut E. coli K12 pÄ en ny blodagar platta.
- Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.
B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förvÀg)
- BerÀkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta ÄtgÄr ett rör med non-nutrient agar.
- SmÀlt non-nutrient agar i kokande vattenbad.
- HÀll den smÀlta agarn i en petriskÄl och lÄt den stelna.
- Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskÄp.
- Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en mÄnad.
Analysdag
1. Rumstemperera agarplattorna
2. HÀll ca 0,5 mL PageŽs saltlösning pÄ blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 ”L bakteriologisk ögla. TillsÀtt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt pÄ varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 ”L bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret fÄr inte vara flytande (lÄt överflödig vÀtska absorberas in i plattan).
3. MÀrk plattorna med analysdatum och provnummer. MÀrk ocksÄ en platta för positiv kontroll och sÀtt undan till punkt 8.
4. LÀgg provmaterial pÄ plattan:
- LinsvÀtska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras pÄ plattan.
- Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. VÀvnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vÀtska!
- Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpÄse med en liten bit fuktad pappershandduk).
6. TvÀtta arbetsytan med 70 % sprit.
7. Byt handskar.
8. SkÀr en ca 1 cm2 stor agarbit frÄn platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan mÀrkt positiv kontroll.
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.
10. Inkubera alla plattor i en vecka.
AvlÀsning och bedömning.
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avlÀsning med patientprov, tvÀtta dÀrefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. LÄt preparaten lufttorka. För fÀrgning med Giemsa se bilaga PAR 09 .
Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.
Trofozoiter kan variera mellan 20â40 ”m i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gĂ„nger per minut. Cystorna, 12â18 ”m i diameter, Ă€r polygonala, har dubbla vĂ€ggar och ser ut som kristaller. GiemsafĂ€rgning: Cytoplasman i fĂ€rgade trofozoiter innehĂ„ller flera vakuoler och har en centralt placerad kĂ€rna med en stor endosom (ref. 3).
Svarsrutin
VÀxt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. pÄvisade i odling.
Ingen vÀxt av Acanthamoeba spp. i odling.
KvalitetssÀkring
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas
Prestanda
Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: Àr i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fÄs vid odling av djup biopsi frÄn hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk pÄvisning kan endast genus anges.
SĂ€kerhetsaspekter och avfallshantering
Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. BÄde cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för mÀnniskor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
Referenser
- Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
- Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
- Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.