PCR-baserade metoder, allmÀnt

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik


PCR-baserade metoder

AllmÀnt

PCR Ă€r en förkortning av det engelska uttrycket ”polymerase chain reaction” och innebĂ€r mĂ„ngfaldigande och pĂ„visande av kĂ€nd nukleinsyra (DNA eller RNA) -sekvens. Kary B. Mullis, fick i mitten av 1980-talet idĂ©n till tekniken som sedan utvecklats och förfinats pĂ„ en mĂ€ngd olika sĂ€tt. IdĂ©n belönades med Nobelpris 1993.

Huvudingredienserna för detektion av DNA med PCR-teknik Àr: DNA-polymeras, primrar, fria nukleotider (dNTP) och templat (mÄl-DNA) som skall pÄvisas. Den inbördes koncentrationen av dessa mÄste optimeras för varje PCR. DÀrtill kommer vÀl avvÀgd Mg2+ eller i vissa fall Mn2+ koncentration, och en buffert för att ge optimal aktivitet hos polymeraset.

DNA-polymeras katalyserar polymerisering av nukleinsyra, i 5’-3’ riktning (figur 8). Med hjĂ€lp av byggstenarna dNTP tillverkas dubbelstrĂ€ngat DNA med enkelstrĂ€ngat templat-DNA som mall. Man anvĂ€nde tidigt DNA-polymeras frĂ„n en bakterie, Thermus aquaticus, som har ett vĂ€rmestabilt polymeras. DĂ€rav kommer namnet Taq-polymeras. Polymeraset har modifierats och finns nu i ett flertal varianter med aktivitet och sensitivitet anpassad för mĂ„nga olika applikationer. NĂ„gra exempel pĂ„ olika DNA-polymeras:


  • som modifierats och mĂ„ste aktiveras genom upphettning vid 95°C i omkring 10 min innan full aktivitet erhĂ„lls vilket ökar reaktionens sensitivitet och specificitet.
  • som lĂ€mpligen anvĂ€nds dĂ„ extra lĂ„nga nukleinsyrasekvenser skall syntetiseras.
  • lĂ€mpliga att anvĂ€nda dĂ„ syntetiserat DNA skall anvĂ€ndas för kloning, pĂ„ nĂ„got sĂ€tt mĂ€rkas eller anvĂ€ndas för sekvensering.
  • att anvĂ€nda dĂ„ extra snabbt DNA-polymeras Ă€r till nytta.
  • som kan anvĂ€ndas dĂ„ sĂ€rskilt hög noggrannhet krĂ€vs.
  • lĂ€mpliga att anvĂ€nda vid polymerisering av mĂ„lsekvens med extra högt innehĂ„ll av kvĂ€vebaserna guanin och cytosin.


Molekylfig8.jpg

Figur 8. Principskiss av PCR dvs mÄngfaldigande av nukleinsyra. Vid varje cykel fördubblas antalet av de DNA-molekyler som primrarna kan baspara till. Bild: Christina Welinder-Olsson.


Primrarna som skall detektera sökt mĂ„lsekvens mĂ„ste designas sĂ„ att de förutom att hybridisera (baspara till mĂ„lsekvensen) i möjligaste mĂ„n inte hybridiserar till varandra och bildar sĂ„ kallade ”primer-dimer”. Det Ă€r ocksĂ„ viktigt att de har samma Tm (har samma smĂ€ltpunkt) och dĂ€rmed kan anvĂ€ndas vid samma annealing temperatur under PCR-reaktionen. Detta erhĂ„lls bla genom att de har ungefĂ€r samma lĂ€ngd, ca 20 bp, och liknande guanin-cytosin innehĂ„ll. Det finns dataprogram för primerdesign att ladda ner frĂ„n internet och det finns ocksĂ„ mjukvara att köpa för detta Ă€ndamĂ„l.

dNTP Àr de fria nukleotiderna dATP, dTTP, dCTP och dGTP som Àr byggstenar i nukleinsyran och som DNA-polymeraset anvÀnder för att polymerisera/bygga en ny DNA-strÀng med enkelstrÀngat DNA som mall.