PulsfÀltgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Hoppa till: navigering, sök

Artikel under utarbetande april 2012. InnehÄllet Àr preliminÀrt i vÀntan pÄ konsensusförfarande


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)


PulsfÀltgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Bakgrund

PulsfÀltgelelektrofores (PFGE) Àr en av de Àldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande Àr i bruk för att jÀmföra bakterieisolat dÄ misstanke om smittspridning finns. PFGE anvÀnds sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var lÀnge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men anvÀnds idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. Vid kartlÀggning av utbrott med MRSA, framförallt med de vanligaste spa-typerna, Àr komplettering med PFGE ofta anvÀndbar.

För varje bakterieart mÄste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE Àr att resultaten inte Àr numeriska och dÀrmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier.

Nedan beskrivs en metod för MRSA som exempel pÄ PFGE-analys.

Indikation

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jÀmföra olika isolat av MRSA.

Provmaterial

Renkultur av Staphylococcus aureus pÄ agarplatta.

Analysprincip

Vid PFGE separeras DNA-fragment i en agarosgel med hjÀlp av en speciell elektroforesutrustning. Den skiljer sig frÄn konventionell gelelektroforesutrustning genom att strömmen istÀllet för att gÄ i ett jÀmt flöde skickas pulsvis frÄn elektroder placerade i vinkel. PFGE möjliggör separation av stora DNA fragment och ger lÀtt analyserbara DNA-bandmönster. Vid PFGE gjuts bakterierna in i en agarosgelplugg i vilken DNA extraheras fram och klyvs till fragment inom lÀmpligt storleksomrÄde med sÀrskilda restriktionsenzymer. Pluggar med klyvt DNA gjuts in i en stor agarosgel som körs i PFGE-utrustningen. Efter avslutad elektrofores fÀrgas och fotograferas gelen. Gelbilden analyseras visuellt eller med hjÀlp av dataprogram.


Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens

  • För analysen behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
  • Referensstam S. aureus NCTC 8325
  • Gjutformar till agarospluggar
  • Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, EtylendiamintetraĂ€ttiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
  • TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
  • Ultra pure TM agarose Invitrogen
  • Restriktionsenzym Sma1 med buffert
  • Gel Red

Analyspocedur

  • DNA-extraktion: Övernattkultur pĂ„ agarplatta slammas i TEN-buffert (cirka 10^9 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenderas bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsĂ€tts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjĂ€lp av pipett som fĂ„r stelna i kylskĂ„p.

Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till tvÄ av bitarna överförda till nytt rör tillsÀtts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlÀgsnas varefter ny kylskÄpskall buffert tillsÀtts repetitivt 4-5 gÄnger.

  • Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma1
    • 1. SpĂ€d buffert (10 ÎŒL reaktionsbuffert + 90 ÎŒL dest.vatten per isolat).
    • 2. TillsĂ€tt 100 ÎŒL buffert till varje centrifugrör.
    • 3. TillsĂ€tt 1 ÎŒL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
    • 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
    • 5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
    • 6. De digererade pluggarna kan anvĂ€ndas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall anvĂ€ndas.
  • Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
    • 1. VĂ€g upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. SmĂ€lt i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
    • 2. LĂ„t svalna ca 56°C. HĂ€ll agarosen i gjutformen. LĂ„t stelna ca. 1 tim.
    • 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa pĂ„ smĂ€lt agarose. Pluggar frĂ„n referensstammen placeras jĂ€mnt fördelat i gelen.
    • 4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
    • 5. HĂ€ll bufferten i PFGE-apparaten. StĂ€ll in kylaggregatet pĂ„ 14°C och starta detta.
    • 6. Placera gelen pĂ„ plats dĂ„ buffert-temperaturen Ă€r 14°C.
    • 7. Starta elforesaggregatet. StĂ€ll in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjĂ€r ramp.
    • 8. Gelen infĂ€rgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Gelbilden analyseras.

Analys av bandmönster

Isolatens bandmönster jÀmförs och grad av genetisk likhet analyseras för att styrka/utesluta möjliga epidemiologiska samband.

Om bandmönstren inte gĂ„r att sĂ€rskilja eller avviker i <3 bandpositioner, bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung. Skiljer bandmönstren i >3 men <7 positioner bedöms bakterieisolaten som möjligen tillhörande ett utbrott eller ha ett gemensamt ursprung. Om bandmönstren skiljer i >7 band, vilket oftast innebĂ€r att cirka 50 % av banden Ă€r av olika storlek, anses inte isolaten ha nĂ„gon gemensam kĂ€lla.

Observera att det inte finns nÄgra absoluta grÀnser för avvikelsernas antal enligt ovan, och slutbedömningen bör helst vÀgas mot övriga epidemiologiska data.

REFERENSER

  • 1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
  • 2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed Field Gel Electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995; 33:2233-2239