Realtids-PCR

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik



Realtids-PCR

Den konventionella PCR-tekniken har vidareutvecklats sÄ att detektion av PCR-produkten sker direkt i PCR-röret och amplifieringen kan följas i realtid. Det finns stora diagnostiska vinster med realtids-PCR jÀmfört med konventionell PCR. En stor fördel Àr att kontamineringsrisken, carry over, minskar drastiskt dÄ amplifierat material inte behöver tas upp ur röret. Efter analys kasseras PCR-produkten i ett slutet rör eller platta. TidsÄtgÄng och arbetsmoment minskar genom att detektionssteget Àr inbyggt i PCR-reaktionen och analyssteg som elektrofores eller blottning inte Àr nödvÀndiga. Vid realtids-PCR sker detektionen av PCR-produkten med hjÀlp av fluorescerande molekyler vilket ökar kÀnsligheten i metoden jÀmfört med traditionell detektion med exempelvis etidiumbromid. De fluorescerande molekyler som anvÀnds kan antingen vara i fri form, vanligtvis SYBR green I, eller bundna till en probe, t ex TaqMan-probe. Fluorescenssignalen som bildas Àr proportionell mot mÀngden amplifierat DNA i realtids-PCR-reaktionen vilket medför att man kan kvantifiera nukleinsyrainnehÄllet i sitt ursprungsprov.

Nedre detektionsnivĂ„ Ă€r teoretiskt en kopia av templat-DNA men det finns ingen garanti för att denna enda kopia kommer att delta i PCR-reaktionen. Om man i ett patientprov har en koncentration av templatet som innebĂ€r att det till PCR-reaktionen i genomsnitt kommer att överföras 2 kopior/reaktion kommer det i ungefĂ€r 10 % av PCR-reaktionerna att saknas ett starttemplat. Om medeltalet istĂ€llet Ă€r 5 kopior/reaktion kommer 99 % av PCR-reaktionerna att ha minst 1 startkopia och med i medeltal 10 kopior/reaktion minskas risken till 0,01 % för falskt negativa resultat.


Probeteknik

Som beskrivits tidigare under PCR allmĂ€nt och figur 8 omges den vid PCR amplifierade sekvensen av tvĂ„ primrar. En probe (hybridiseringssond, ibland kallat sökfragment) för realtids-PCR Ă€r lokaliserad uppströms den ena primern och inom amplifieringsomrĂ„det. Proben bestĂ„r av en oligonukleotid, precis som primern, men Ă€r inmĂ€rkt med en fluorofor och/eller quencher, ”slĂ€ckare”. Man skiljer vanligtvis mellan en hydrolysprobe (tex TaqMan-probe) och hybridiseringsprobe (tex FRET-probe eller Molecular beacon-probe). Genom att anvĂ€nda probeteknik vid realtids-PCR ökar man specificiteten för PCR-reaktionen. Samtidigt ökar risken för falskt negativa resultat i de fall mutationer skulle ha uppstĂ„tt i bindningsomrĂ„det för proben i mĂ„l-DNA-molekylen.


TaqMan-probe

Den vanligaste typen av hydrolysprobe Ă€r TaqMan-probe. Den Ă€r i sin 5’-Ă€nde inmĂ€rkt med en fluorofor, en sĂ„ kallad reporter och i sin 3’-Ă€nde inmĂ€rkt med en quencher. Vid amplifiering binder proben in till mĂ„l-DNA och under elongeringsfasen hydrolyseras proben, bryts ned, av Taq-polymerasets 5’-exonukleas aktivitet varvid reporter och quencher skiljs Ă„t (figur 9). Energin frĂ„n den fria och exciterade reportern absorberas inte lĂ€ngre av quenchern utan tas nu upp av detektorn i realtids-PCR-instrumentet. Specificiteten för en TaqMan-probe kan ökas genom att man i 3’-Ă€nden fĂ€ster en sĂ„ kallad minorgroove binder (MGB)-molekyl. PCR-reaktionen blir nu mer robust dĂ„ MGB-molekylen binder hĂ„rdare till DNA-molekylen, vilket innebĂ€r att probens smĂ€ltvĂ€rde (Tm) ökar. Hydrolysprober fungerar bĂ€st vid tvĂ„stegs-PCR, vilket innebĂ€r att annealing och elongeringsfaserna slĂ„s samman till en fas i PCR-reaktionen.

Figur 9. TaqMan-probe. (A) Principen för en TaqMan-probe Àr att probe och primer binder in till templatet dÀr en intakt probe inte avger nÄgon emissionsenergi. (B) Vid elongering avlÀgsnas fluoroforen (reporter) vilket medför att man kan mÀta energin frÄn den fria fluoroforen. Bild: © QIAGEN, all rights reserved

FRET-probe

Första exemplet pĂ„ en hybridiseringsprobe Ă€r Fluorescence Resonance Energy Transfer-probe som förkortas FRET-probe. Den bestĂ„r av tvĂ„ oligonukleotider inmĂ€rkta med varsin fluorofor men med olika excitations- och emissionsspektra. Proberna Ă€r designade sĂ„ att de hybridiserar, binder in, till mĂ„l-DNA med endast nĂ„gra basers mellanrum. Den första probens fluorofor Ă€r inmĂ€rkt i probens 3’-Ă€nde och kallas donatorfluorofor. Den andre probens fluorofor Ă€r inmĂ€rkt i dess 5’-Ă€nde och kallas mottagarfluorofor. Principen för detektion Ă€r att proberna binder in till mĂ„l-DNA och donatorfluoroforen exiteras av realtids-PCR-instrumentet, dess emissionsenergi överförs till mottagarfluoroforen som blir exiterad och en tredje energi frigörs frĂ„n mottagarfluoroforen som tas upp av detektorn i realtids-PCR-instrumentet (figur 10). Denna energiövergĂ„ng fungerar inte i fri lösning dĂ„ proberna inte Ă€r hybridiserade nĂ€ra varandra. I PCR-reaktionens denatureringsfas smĂ€lter, lossnar, proberna frĂ„n mĂ„l-DNA och kan Ă„teranvĂ€ndas, till skillnad frĂ„n en TaqMan-probe som hydrolyseras. Efter PCR-reaktionen kan man utföra en smĂ€ltanalys för att fĂ„ fram smĂ€ltvĂ€rdet för proberna till amplikonet. Man kan utnyttja smĂ€ltanalysen för att sĂ€rskilja olika genotyper som exempel för adenovirus. I detta exempel amplifieras och detekteras bĂ„de serotyp 40 och 41 av samma primerpar och prober men vid smĂ€ltanalys fĂ„r de olika vĂ€rden beroende pĂ„ serotyp. Detta beror pĂ„ att proberna binder olika hĂ„rt till de tvĂ„ serotypamplikonen dĂ„ en av serotyperna har en eller flera mis-match dĂ€r proben hybridiserar dvs binder.

Figur 10. FRET-probe. (A) Donatorproben i fri form avger energi medan mottagarproben (acceptor) inte avger nÄgon energi. (B) Under annealingsteget binder bÄda prober in och energin frÄn donatorproben överförs till mottagarproben som exiteras och vars emissionsenergi kan detekteras i PCR-instrumentet. (C) NÀr proberna avlÀgsnas sker ingen energiöverföring mellan proberna och signalen slÀcks ned. Bild: © QIAGEN, all rights reserved

Molecular beacon-probe

Molecular beacon-probe (beacon betyder fyr) Ă€r ett annat exempel pĂ„ hybridiseringsprobe. Proben har tvĂ„ specifika strukturella former, en stam och en ögla (figur 11). Stamstrukturen hĂ„lles samman genom hybridisering dĂ„ kvĂ€vebaserna Ă€r sĂ„ valda att de basparar till varandra i fri lösning. Vardera 5’- respektive 3’-Ă€ndarna Ă€r inmĂ€rkta med en reporterfluorofor respektive quencher. Specificiteten för molecular beacon-proben ligger i öglans nukleinsyrasekvens vilken Ă€r komplementĂ€r till mĂ„l-DNA. Under PCR-reaktionen smĂ€lter stamstrukturen isĂ€r och om öglestrukturen hybridiserar till mĂ„l-DNA separeras reporter och quencher fysiskt. DĂ€rvid exiteras reportern dess emissionsenergi tas upp av detektorn i realtids-PCR-maskinen. PĂ„ samma sĂ€tt som FRET-probe kan den Ă„teranvĂ€ndas efter denaturering.

Figur 11. Molecular beacon-probe. (A) Molecular beacon-probe i fri form Àr reporter (fluorofor) och quencher nÀra varandra och all energi frÄn fluoroforen tas upp av quenchern. (B) NÀr proben bundit till templatet skiljs fluorofor och quencher Ät sÄ fluoroforens emissionsenergi kan detekteras av PCR-instrumentet. (C) NÀr proben avlÀgsnas ÄtergÄr den till sitt ursprung i form av en hÄrnÄls struktur. Bild: © QIAGEN, all rights reserved

SYBR Green

SYBR Green I Àr en cyaninfÀrg som Àr specifik för dubbelstrÀngat DNA och binder in till minorgroove i DNA-molekylens α-helix. Endast inbundet SYBR Green I kan exiteras och avge emissionsenergi (figur 12). Samtidigt Àr inbindningen ospecifik dÄ SYBR Green I binder in till allt dubbelstrÀngat DNA. Om en PCR-reaktion inte Àr fullstÀndigt optimerad binder SYBR Green I till, förutom önskat amplikon, Àven till biprodukter som tex primer-dimer.



Figur 12. SYBR Green. Principen för SYBR Green I baserad detektion Àr att ju mer SYBR Green I som binder in till dubbelstrÀngat DNA ju mer emissionsenergi avges. Bild: © QIAGEN, all rights reserved


Efter avslutad amplifiering utförs i realtids-PCR-instrumentet en smÀltpunktsanalys som kan skilja mellan amplikonet och eventuella biprodukter (figur 13). SmÀltpunkten hos dubbelstrÀngat DNA beror pÄ sekvensens lÀngd och nukleinsyrasammansÀttningen vilket gör varje amplikon specifikt gÀllande smÀltpunkt. SmÀltpunktsanalys utförs genom att temperaturen gradvis ökas med nÄgra tiondels grader per sekund och fluorescensen mÀts kontinuerligt. SmÀltpunkten definieras som den temperatur dÀr hÀlften av DNA-strÀngarna har separerats och dÀrmed hÀlften av SYBR Green I molekylerna lossnat frÄn DNA. Detta kan förtydligas med berÀkning av den negativa derivatan av funktionen fluorescensintensitet mot temperaturen dÀr smÀltpunkten motsvarar en topp i diagrammet. Ett sÀtt att öka specificiteten hos SYBR Green I under en PCR-reaktion Àr att utföra mÀtning av emissionsenergin vid en temperatur (TmÀtning) som Àr under smÀltpunkten för amplikonet (TmPCR-produkt) men högre Àn smÀltpunkten för tex primer-dimer (Tmprimer-dimer) enligt följande Tmprimer-dimer <TmÀtning < TmPCR-produkt. Det man uppnÄr Àr att man mÀter amplifiering av endast amplikonet och inte summan av biprodukt plus amplikon. En tumregel Àr att TmÀtning ligger ungefÀr 5°C under TmPCR-produkt. SmÀltpunktsanalys kan ocksÄ genomföras med hydrolysprober som FRET-probe och molecular beacon-probe dÀr varje probes smÀltpunkt Àr specifik och man kan skilja pÄ olika prober i samma PCR-reaktion, vid tex multiplex PCR.

High-resolution melting, HRM, Àr en utveckling av smÀltpunktsanalys dÀr man kan fÄ fram mer detaljerad information om amplikonets sammansÀttning. Metoden anvÀnds för att upptÀcka genetiska variationer som tex SNP (singel nucleotide polymorphism) och mutationer vilket medför att ett anvÀndningsomrÄde Àr typning av bakterier och virus. Man kan Àven anvÀnda tekniken till att upptÀcka nya, okÀnda varianter, sk gene scanning. Metoden upptÀcker en blandning av olika amplikon med en liten skillnad i bas-sammansÀttningen (tex SNP) vilket visas som högupplösta smÀltkurvor. MÀngdförhÄllandet mellan olika amplikon kan ocksÄ skilja mycket men framkommer i analysen. Metoden krÀver PCR-maskiner med analysprogram utvecklade för HRM. SYBR Green fungerar till viss del som analysfÀrg men det finns specifikt utvecklade fÀrger för HRM-analys, exempelvis Eva Green, LC Green och ResoLight. HRM Àr kostnadsmÀssigt en billigare metod Àn probetekniken.

Figur 13. SmÀltanalys. (A) Vid lÄg temperatur Àr all SYBR Green I inbundet till intakt dubbelstrÀngat DNA och mycket fluorescens kan detekteras. (B) SmÀltpunkten (Tm) för PCR-produkten Àr nÀr hÀlften av DNA-strÀngarna separerats och hÀlften av SYBR Green I molekylerna Àr i fri form. Detta illustreras i den nedre kurvan (negativa derivatan av den övre kurvan) som en topp, smÀlttopp. (C) Alla DNA-strÀngar Àr separerade och ingen energi avges frÄn SYBR Green I. Bild: Fredrik Aronsson

LUX primer

LUX stĂ„r för light upon extension . Den ena primern i primerparet har i fri lösning formen av en hĂ„rnĂ„l (figur 14) vilket innebĂ€r att primern fĂ„r en stamstruktur dĂ„ den hybridiserar till sig sjĂ€lv. Primern Ă€r inmĂ€rkt med en fluorofor nĂ€ra 3’-Ă€nden i stamstrukturen och Ă€r 20-30 baser i lĂ€ngd. NĂ€r den Ă€r i denna form Ă€r fluoroforen slĂ€ckt och det behövs ingen separat quencher för att slĂ€cka den. NĂ€r primern Ă€r inkorporerad i dubbelstrĂ€ngat DNA i PCR-produkten ökar fluorescenssignalen frĂ„n LUX primern vilket kan detekteras i realtids-PCR-instrumentet. Fördelen med denna teknik Ă€r att det inte behövs nĂ„gon probe för att uppnĂ„ hög kĂ€nslighet vilket ocksĂ„ medför en lĂ€gre kostnad. Specificiteten minskar nĂ„got jĂ€mfört med en probe men att designa ett primerpar Ă€r enklare Ă€n att designa bĂ„de ett primerpar och en probe. Med LUX-tekniken har man Ă€ven möjlighet att genomföra en smĂ€ltpunktsanalys för amplikonverifiering.


Figur 14. LUX primer. Principen för LUX primer Àr att den i sin ursprungsform, hÄrnÄl, avger lite energi medan inbundet som dubbelstrÀngat DNA avger mycket energi. Ju fler amplikon som LUX primern inkorporerats i desto mer energi kan detekteras i PCR-instrumentet. Bild: Invitrogen, publicerad med tillstÄnd frÄn företaget.

Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys

Vid en realtids-PCR-analys erhÄlls en amplifieringskurva för positiva PCR-reaktioner (figur 15). Antalet amplikon ökar exponentiellt och dÀrmed signalen tills en platÄfas nÄs vilket frÀmst beror pÄ att aktiviteten hos Taq-polymeraset Àr förbrukad men Àven pÄ att fria nukleotider, primers och probe tar slut eller pÄ att PCR-produkter finns i sÄdant överskott att DNA-strÀngarna i dessa hittar och hybridiserar till varandra oftare Àn till primer och probe. I analysen lÀgger man in eller har förprogrammerat ett tröskelvÀrde vilket motsvarar den fluorescensnivÄ som tillvÀxtkurvan ska passera för att tolka provet som positivt. Vid den punkt dÀr amplifieringskurvan skÀr tröskelvÀrdet kan man pÄ x-axeln avlÀsa cykeltröskelvÀrdet (Ct-vÀrde) för det positiva provet. Vid kvalitativ analys vill man pÄvisa eller inte pÄvisa sökt nukleinsyra. PÄvisas nukleinsyran fÄr man ett Ct-vÀrde, annars inte.

Ett prov med lÄgt Ct-vÀrde innehÄller frÄn början fler starttemplat jÀmfört med ett prov med högre Ct-vÀrde. Detta utnyttjas vid kvantitativ analys dÀr prover med okÀnd koncentration jÀmförs mot en standardkurva baserad pÄ ett antal standardprov som analyseras samtidigt med proverna. Det Àr viktigt att tröskeln passeras i tillvÀxtfasen, logfasen, av amplifieringskurvan för att fÄ ett korrekt Ct-vÀrde. Om man statistiskt kan visa att standardkurvan inte förÀndras mellan olika PCR-analyser behöver man inte analysera standardprover vid varje analystillfÀlle. Vid detta tillfÀlle anvÀnder man dÄ en fÀrdig standardkurva i analysmjukvaran. NÀr man jÀmför Ct-vÀrdet mellan olika PCR-analyser och saknar en standardkurva Àr det viktigt att tröskeln har ett fast vÀrde mellan de olika analyserna.

Kvantitativ realtids-PCR bygger pĂ„ att man har en hög effektivitet i PCR-reaktionen vilket kan berĂ€knas enligt formeln 1/log (effektivitet) = cykel/log [DNA]. Vid effektiviteten 2.0 dvs 100 % sĂ„ ökar cykeltalet med 3.32 cykler vid en spĂ€dningsserie pĂ„ 1:10. Effektiviteten minskar oftast vid höga Ct-vĂ€rden nĂ€r fĂ€rre starttemplat finns tillgĂ€ngliga för PCR-reaktionen. DĂ€rför begrĂ€nsar man ofta den kvantitativa realtids-PCR till ett omrĂ„de dĂ€r effektiviteten Ă€r hög och med det en större sĂ€kerhet i svaret. VĂ€rden utanför omrĂ„det tillskriver man mer Ă€n eller mindre Ă€n metodens mĂ€tbara antal kopior/mL.

Figur 15. Amplifierningskurva. NÀr amplifieringskurvan passerar tröskeln kan man avlÀsa cykeltröskelvÀrdet (Ct-vÀrdet) för en positiv PCR-reaktion. NÀr man jÀmför Ct-vÀrden innebÀr ett lÀgre Ct-vÀrde att det finns mer starttemplat, DNA/RNA, i provet jÀmfört med ett Ct-vÀrde som Àr högre. Bild: Fredrik Aronsson

REFERENSER

  • 1. Molecular microbiology: diagnostic principles and practice / editors, David H Persing et al. ASM press, Washington DC, 2004.
  • 2. The polymerase chain reaction / editors Kary B Mullis et al. BirkhĂ€user, Boston, 1994.
  • 3. Nazarenko, I et al. Nucleic Acids Research 2002; 30(9): e37.
  • 4. Jothikumar, N. et al. Quantitative Real-Time PCR Assays for Detection of Human Adenoviruses and Identification of Serotype 40 and 41. Appl Environ Microbiol 2005; 71:3131-3136.