Salmonella-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Salmonella


Laboratoriediagnostik av Salmonella

AllmÀnt

Vid septiska tillstÄnd bör blododling utföras. NÀr det gÀller primÀrisolering av Salmonella-bakterier frÄn feces finns det vissa brister i diagnostiken som framgÄr av avsnittet KvalitetssÀkring.

SÀkerhetsaspekter: Observera att Salmonella Typhi sedan den 31 mars 1998 klassas som Biosafety level (BSL) 3** patogen (se vidare detta avsnitt).Vid misstanke om S. Typhi Àr det viktigt att detta anges pÄ remissen. MisstÀnkt S. Typhi Àr en stam som jÀser mannit utan gasutveckling och som Àr OD-negativ.

Referensmetodik

Referenssubstrat

NedanstÄende substrat utgör referenssubstrat vid primÀrisolering av Salmonella-bakterier frÄn humana fecesprov (se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat). Generellt rekommenderas nÄgot av de kommersiella halvfabrikat som finns pÄ marknaden. AngÄende testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se bilaga 1.2 - substratkontroll.

XLD-agar: PĂ„ XLD-agar vĂ€xer Salmonella-bakterier inom ett dygn som regel med ett growth index (GI) jĂ€mfört mot blod eller CLED-agar överstigande 50 %.

DC-agar: Den nĂ„got mer selektiva HynesÂŽ modifikation utgör referenssubstrat. PĂ„ DC-agar vĂ€xer Salmonella-bakterier inom tvĂ„ dygn med GI överstigande 50 % jĂ€mfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall.

MacConkey-agar: Salmonella-bakterier vĂ€xer inom ett dygn med GI överstigande 80 % jĂ€mfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall (undantag t.ex. S. Senftenberg CCUG 37886). Kolonierna Ă€r dĂ€rvid konvexa, semiopaka, blanka, ibland rĂ„a och fĂ€rglösa. Kolonidiametern motsvarar den för DC-Hynes. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn.

För anrikning Àr Rappaportbuljong (Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat) referenssubstrat lÀmpad för alla typer av Salmonella (ej S. Typhi) med inkubering vid 41,5 °C + 0,5 °C.

Isolering

PrimÀr odling

Salmonella-bakterier tillvĂ€xer bĂ„de aerobt och anaerobt inom ett brett temperaturomrĂ„de, +8 °C – 45 °C men optimalt vid 37 °C , och inom ett pH-intervall 4-8. PrimĂ€r utodling: Provmaterial pĂ„ provtagningspinne stryks ut pĂ„ XLD-agar och DC-agar varefter sekundĂ€rstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C – 37 °C . XLD-plattan avlĂ€ses efter 1 dygn samt DC-plattan efter ett och tvĂ„ dygn.

Anrikning och sekundÀr utodling: Efter det primÀra utstryket stoppas provtagningspinnen ner i Rappaportbuljong och inkuberas i 41,5 °C + 0,5 °C över natt. Med plastinös görs dÀrefter utstryk och sekundÀrstryk pÄ XLD-agar. Plattan inkuberas vid 35 °C - 37 °C över natt och avlÀses.

Identifiering och minimikriterier

Presumtiv diagnos

PĂ„ XLD-agar Ă€r kolonierna semiopaka, slĂ€ta, blanka och fĂ€rglösa (framstĂ„r röda mot mediets grundfĂ€rg). Kolonierna Ă€r ofta stora med diameter >2 mm och ett distinkt svart centrum. Observera att atypiska LD-negativa och/eller laktosjĂ€sande Salmonella, i likhet med andra koliforma bakterier, kan vĂ€xa med gulfĂ€rgade, opaka kolonier. Observera att S. Typhi sĂ€llan blir H2S-positiv pĂ„ XLD. Inkuberas i 35 °C - 37 °C och avlĂ€ses efter ett dygn. PĂ„ DC-agar Ă€r kolonierna semiopaka, blanka, fĂ€rglösa, och i mer Ă€n hĂ€lften av fallen med grĂ„tt eller svart centrum. De flesta stammar vĂ€xer ut redan inom ett dygn. Kolonidiametern Ă€r ofta mindre Ă€n motsvarande pĂ„ XLD. Inkuberas i 35 °C – 37 °C och avlĂ€ses efter ett och tvĂ„ dygn.

Slutlig diagnos

MisstĂ€nkta kolonier plockas och karakteriseras med testbatteri (enligt Tabell 8) som inkuberas över natten i 35 °C – 37 °C . För beskrivning av de ingĂ„ende substraten se artikel Biokemiska referenssubstrat för identifiering av Salmonella, Shigella och Yersinia i rutindiagnostiken. Om biokemin Ă€r typisk enligt rad 1 Ă€r ingen ytterligare diagnostik nödvĂ€ndig. Isolatet anses identifierat som Salmonella species. Vid biokemiskt utfall enligt rad 2 - 4 mĂ„ste kompletterande test med agglutination i polyvalent O-serum utföras. UngefĂ€r 95 % av kliniska isolat agglutinerar i poly O. Korsreaktivitet med andra species inom Enterobacteriaceae t.ex. E. coli kan förekomma. Kompletteringstestet skall vara positivt. Tillsammans med nĂ„got av de biokemiska utfallen i Tabell 8 rad 2 - 4 anses isolatet identifierat som Salmonella species.

Salmonelltabell8.jpg


Om kompletteringstestet utfaller negativt eller om biokemin inte Àr konklusiv görs komplettering med kommersiell analysbricka, t.ex. API 20E (Bio Merieux, Frankrike). KvarstÄr misstanke om Salmonella species skickas isolatet till FolkhÀlsomyndigheten för verifiering.

Avvikelser frÄn referensmetodiken

Referensmetodiken anger en miniminivÄ för diagnostiken. Vissa avvikelser kan dock vara acceptabla.

Substrat

Vid primĂ€risolering kan ett av de selektiva referensagarmedierna ersĂ€ttas av ytterligare en anrikningsbuljong (Rappaport i kombination med Selenit).Selenit-buljong Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat (laktosbaserad) Ă€r lĂ€mpad för anrikning av alla typer av Salmonella species direkt i fecesprov vid en inkuberingstemperatur av 35 °C (ibland anges 42 °C som lĂ€mplig inkuberingstemperatur Ă€ven för Selenit-buljong).

XLD-agar kan bytas mot t.ex. Hektoen-agar (Bilaga 1). SSI-Enteric medium (Bilaga 1) kan ocksÄ vara ett alternativ men svenska erfarenheter Àr begrÀnsade.

Kompletterande test

Som kompletterande test kan nÄgon av nedanstÄende ersÀtta agglutination i polyvalent serum:

  • Salmonella-fag(Reagensia AB). Majoriteten av alla kliniska isolat av Salmonella (ca 95 %) Ă€r kĂ€nsliga för bakteriofag Felix O-1 (FO). Denna test Ă€r dĂ€rför ett bra komplement till den biokemiska identifieringen. Bland andra enterobakterier Ă€r det frĂ€mst E. coli som kan vara kĂ€nslig. Av praktiska skĂ€l Ă€r det lĂ€mpligt att redan i samband med renspridning pĂ„ MacConkey-plattan applicera en droppe fag pĂ„ primĂ€rstryket.
  • MUCAP-test (Svenska Labfab AB). Salmonella tycks vara unik inom Enterobacteriaceae genom att ha ett C8-esteras som hydrolyserar metylumbelliferylkaprilat. Fritt metylumbelliferyl fluorescerar i UV-ljus. Testen genomförs sĂ„ att en droppe av reagensen appliceras pĂ„ bakterierna pĂ„ en utvuxen agarkultur, t.ex. MacConkey. Fluorescens avlĂ€ses i relativt mörker inom fem minuter. Som UV-kĂ€lla kan ofta anvĂ€ndas en UV-lampa av sĂ„dan typ som anvĂ€nds för kontroll av sedlar (referensfrekvens Woods light = 366 nm). NĂ€r detta reagens testades pĂ„ 750 isolat av Salmonella var 749 positiva i testen. Av 130 andra enterobakterier var endast en stam av Hafnia alvei positiv. MĂ„nga oxidaspositiva bakterier som Pseudomonas species och liknande bakterier kan ge positivt testresultat, medan negativt test kan förekomma hos laktospositiva Salmonella-isolat.

Övrig diagnostik

Ingen kommersiell snabbdiagnostik finns idag tillgÀnglig för humana fecesprov. PÄ veterinÀr- och livsmedelssidan förekommer de dock.

Serologi

Vissa laboratorier pÄvisar förekomst av IgG och IgM antikroppar med en LPS-ELISA som detekterar antikroppar mot faktorerna O4 och O9. Denna serologi kan i vissa fall anvÀndas för diagnostik av Salmonella-infektion. Den klassiska Widal testen, pÄvisande av antikroppar mot Salmonella Typhi med avdödade bakterier som antigen, torde inte fylla nÄgon plats i modern infektionsdiagnostik.

Epidemiologisk typning

Stam som av insÀndaren identifierats som Salmonella species sÀnds till FolkhÀlsomyndigheten för epidemiologisk typning i de fall smittan identifierats som inhemsk och vid utlandssmitta endast om sÀrskilda omstÀndigheter föreligger. Vid klara utbrott eller epidemier sÀnds endast ett representativt urval av stammar. Hos kÀnd smittbÀrare skall ej konsekutiva isolat sÀndas för typning. Avsikten med typning Àr att följa smittspridning, frÀmst inom landet. I de fall laboratoriet kÀnner till smittort Àr det av epidemiologiska skÀl dÀrför mycket viktigt att detta anges dÄ det pÄskyndar den epidemiologiska handlÀggningen, speciellt vid utbrott.

Typning görs idag primÀrt med serologisk teknik. FullstÀndig typning görs vid FolkhÀlsomyndigheten och för veterinÀra isolat vid Statens VeterinÀrmedicinska Anstalt (SVA).

Motiverar smittspĂ„rningsarbetet ytterligare differentiering kan fagtypning och molekylĂ€rgenetisk metodik anvĂ€ndas. Fagtypning av S. Enteritidis utförs vid FolkhĂ€lsomyndigheten. Fagtypningen kan framöver komma att ersĂ€ttas av MLVA. Även resistensmönstret Ă€r ofta till hjĂ€lp vid uppföljning av utbrott.

Kvalitetskontroll

Metodkalibrering förvÀntas ske pÄ sÀtt som anges under avsnittet kvalitetssÀkring i den allmÀnna delen.

Referensstammar

I tabell 9 listas de stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer: Fecestabell9.jpg


Fecestabell9b.jpg

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets traditioner. Följande bör dÀrvid iakttas: Vid premiÀrisolering anges fynd av Salmonella species och att isolatet sÀnds till FolkhÀlsomyndigheten för epidemiologisk typning vid inhemsk smitta (se nedan). Efter erhÄllet typningssvar meddelas detta till inremitterande med angivelse av serotypnamn. Ev. fagtyp behöver dÀremot inte anges. Vid utlandssmitta eller senare positiva kontrollodlingar rÀcker det att svara vÀxt av Salmonella-bakterier (utan angivande av serotypnamn). Resistensmönster anges endast pÄ begÀran frÄn kliniken.