Screeningmetodik för ESBL

Artikel under utarbetande mars 2012.

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar

och

falldefinitionen ESBL-producerande Enterobacteriaceae

Screeningmetoder för ESBL[redigera]

Bakgrund[redigera]

ESBL indelas i tre huvudgrupper; ESBL_A, ESBL_M och ESBL_CARBA. ESBL_A är hittills dominerande i Sverige, men ESBL_M, i första hand av subgrupp CIT förekommer också. Antalet anmälda fall av ESBL(_Aeller_M) har stadigt ökat från 2008 (år 2007 då anmälningsplikt infördes för laboratorier) till mer än 5000 (år 2011). Beträffande Enterobacteriaceae med ESBL_CARBA som sedan 15 mars 2012 är anmälningspliktig för både laboratorium och behandlande läkare, inkluderades denna variant av ESBL i den svenska definitionen för ESBL år 2009 . Från 2007 till 2011 fanns 35 fall rapporterade till Smittskyddsinstitutet och av dessa var det stora flertalet smittade utomlands. Enterobacteriaceae med ESBL_CARBA är smittspårningspliktiga. Aktuella föreskrifter (SOSFS 2012:1, 2012:2 och 2007:1) finns på Socialstyrelsens webbplats.

Screeningmetoden följer de rekommendationer som anges i Folkhälsomyndighetens (SMI:s) kunskapsunderlag [1] som publiceras våren 2013.

De flesta laboratorier i landet har etablerat metoder för screening av ESBL-producerande tarmbakterier. Dessa baseras på användningen av kommersiella agarplattor (t ex Oxoid, bioMérieux), egentillverkade agarmedier med antibiotikalappar eller selektiv buljonganrikning. Litteraturstöd saknas i dagsläget för att buljonganrikning skulle ha högre känslighet än övriga metoder.

För screeningändamål kan ett cefalosporin som är substrat för samtliga ESBL-varianter användas, exempelvis cefpodoxim. Däremot är metodik som baserar sig på endast en av cefotaxim eller ceftazidim inte tillräcklig, eftersom vissa ESBL-enzymer inte orsakar resistens mot båda dessa cefalosporiner.

Referensmetodik[redigera]

Provmaterial[redigera]

Till följd av brist på data som stödjer att buljonganrikning skulle ge högre känslighet anses bruket av screening-agarplattor (feces, rektumprov på pinne) vara referensmetodik för primärisolering av ESBL från kliniskt screeningprov.

Substrat[redigera]

Egentillverkade substrat: Två plattor vardera med agarbaserat substrat (exempelvis MacConkey), en innehållande cefotaxim 1 mg/L och en innehållande ceftazidim 1 mg/L.

Kommersiella substrat: Flera kommersiella screeningagarmedier har jämförts i olika studier, och uppvisar goda prestanda när det gäller detektion av ESBL_A, men inget av dessa kan dock anges som formellt referenssubstrat. Känsligheten för detektion av ESBL_M är sämre, eftersom man ofta har tillsatt AmpC-hämmare till mediet. Detta görs för att med hög specificitet detektera ESBL_A, vilket är relevant i många länder utanför Norden. Se också artikel Kromogena substrat.

Karbapenemaser kan med hög känslighet påvisas med de beskrivna substraten, eftersom dessa i de allra flesta fall även orsakar cefalosporinresistens. Undantag är karbapenemasen OXA-48 som ibland kan orsaka låggradig karbapenemresistens utan samtidig cefalosporinresistens. Kommersiella plattor innehållande karbapenemer har hög specificitet, men för låg känslighet för att generellt kunna rekommenderas för detektion av karbapenemas-bildande bakterier.

För detektion av OXA-48 kan kommersiella screeningplattor för karbapenemaser (innehåller oftast ertapenem) eller egentillverkade substrat med tillsats av ertapenem eller meropenem (0, 25 mg/L) användas. Alternativ kan vara MacConkey med meropenemlapp i första stryket.

Provsättning och inkubering[redigera]

Proven stryks på plattorna enligt gängse odlingsprinciper.

Plattor inkuberas över natt i luft (36 °C).

Isolering och verifiering[redigera]

Kolonier som efter inkubering över natt växer på något av de använda substraten skall misstänkas vara ESBL-producerande.

Artbestämning görs enligt gängse principer.

Exempel på tre fasta substrat avsedda för påvisning av ESBL från screeningprov från feces. Till vänster och i mitten exempel på selektiva ej kromogena substrat: Delad platta (BLSE-agar (Microgen bioproducts Ltd, UK), MacConkey med cefotaxim och Drigalski med ceftazidim) och in house MacConkey med cefotaxim. Till höger kommersiell kromogen ESBL-platta (bioMerieux). Bilden visar utodlat screeningprov från feces. De misstänkta bakterierna utgjordes av E. coli och Enterobacter species. Foto; Camilla Svensson.

Fenotypisk verifiering av ESBL enligt algoritmer som anvisas i aktuell NordicAST-tabell.

Beträffande E. coli och Shigella spp. med fenotypisk misstanke om ESBL_M bör verifierande PCR enligt bilaga 1 utföras för att skilja på förvärvad och kromosomalt medierad AmpC (1, 2).

Enterobacteriaceae med fenotypisk ESBL_CARBA bör skickas till SMI för verifiering för att snabbt identifiera en eventuell nationell smittspridning. Genotypisk diagnostik av ESBL_CARBA bör endast utföras på laboratorier somhar tillräckligt många fall och därmed erfarenhet av dessa metoder. Det finns flera publicerade PCR-protokoll för de flesta av de vanliga karbapenemasvarianterna.

Epidemiologisk typning[redigera]

Pulsfältsgelelektrofores (PFGE) är standard för epidemiologisk typning av ESBL-producerande bakterier. Alternativa metoder finns tillgängliga, däribland en kommersiell metod, DiversiLab System (bioMerieux) (3), som baserar sig på PCR-amplifikation av specifika regioner mellan bakteriella sekvenser. Denna har i en studie genomförd på SMI, visats ha god upplösning bland PFGE-relaterade ESBL-isolat, men inte lika god upplösning som PFGE. En fördel med DiversiLabs system är att det är betydligt snabbare och till stor del automatiserat, inklusive tolkningssteget. En nackdel är att det inte finns någon internationell konsensus om typbeteckningar, vilket försvårar jämförelser och tolkningar på nationell och internationell nivå.

Bland alternativa metoder för epidemiologisk typning av ESBL-producerande Enterobacteriaceae kan nämnas MLST och MLVA (4).

För en detaljerad beskrivning hänvisas till Folkhälsomyndighetens (SMI:s) kunskapsunderlag [2].

Svarsrutiner[redigera]

Bakterier med ESBL_A eller ESBL_M svaras ut med art och resistenstabell enligt laboratoriets vanliga rutiner, följt av upplysningen att bakterien är ESBL-producerande. ESBL_CARBA-producerande Enterobacteriaceae svaras ut med angivande av art och resistenstabell enligt laboratoriets vanliga rutiner, följt av upplysningen att bakterien producerar ESBL_CARBA.

Laboratorieanmälan[redigera]

ESBL-producerande Enterobacteriaceae enligt gällande falldefinition.

Referensfunktioner[redigera]

Ej beslutade

REFERENSER[redigera]

1. Brolund A, Wisell KT, Edquist PJ, Elfstrom L, Walder M, Giske CG. Development of a real-time SYBRGreen PCR assay for rapid detection of acquired AmpC in Enterobacteriaceae. J Microbiol Methods. 2010 Sep;82(3):229-33.
2. Perez-Perez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol. 2002 Jun;40(6):2153-62.
3. Brolund A, Haeggman S, Edquist P, Gezelius L, Olsson-Liljequist B, Tegmark Wisell K, Giske C. The DiversiLab system versus pulsed-field gel electrophoresis: Characterisation of extended spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Journal of Microbiological Methods 2010;873:224-230.
4. Naseer U, Olsson-Liljequist, B.E, Woodford N, Dhanji H, Cantón R, Sundfjord A, Lindstedt B-A. Multi-Locus variable number of tandem repeat analysis for rapid and accurate typing of virulent multidrug resistant Escherichia coli clones. PloS ONE 7(7):e41232.doi:10.1371/journal.pone.0041232