Shigella-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Shigella



Laboratoriediagnostik

SĂ€kerhetsaspekter

Det skall frÄn början klargöras att infektionsdosen för Shigella Àr mycket liten. Vid allt arbete med levande Shigella-bakterier eller misstÀnkt Shigella Àr det viktigt att adekvat skyddsutrustning anvÀnds. Att notera Àr att Sh. dysenteriae typ 1 sedan 1998 (AFS 1997:12) Àr placerad i skyddsklass 3(**) och att det krÀvs tillstÄnd av AV för att fÄ arbeta med denna bakterie.

Referensmetodik

Referenssubstrat

NedanstÄende substrat utgör referenssubstrat för isolering av Shigella-bakterier frÄn humana fecesprov (recepten Äterfinns i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat).

Generellt rekommenderas nÄgot av de kommersiella halvfabrikat som finns pÄ marknaden. AngÄende testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial om substratkontroll.

XLD-agar: Shigella-bakterier vÀxer inom ett dygn med semiopaka, slÀta och blanka fÀrglösa 0,5-2 mm stora kolonier (framstÄr röda mot mediets grundfÀrg). SÀrskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation inom och mellan kolonier. RÄa kolonier med ojÀmna kanter kan dÀrvid förekomma.

Shigella species vÀxer i allmÀnhet med lÀgre GI Àn Salmonella, vissa stammar vÀxer inte alls.

DC-agar modifierad enligt Hynes: Shigella-bakterier vĂ€xer inom tvĂ„ dygn (ca 1/3 av stammar har inte vĂ€xt ut efter ett dygn) med relativt lĂ„ga GI-vĂ€rden, ofta mindre Ă€n 50 %. Upp till 20 % av stammar som vĂ€xer pĂ„ icke inhibitoriskt substrat eller pĂ„ XLD uppvisar mycket dĂ„lig eller ingen vĂ€xt.

MacConkey-agar: Shigella-bakterier vĂ€xer inom ett dygn (GI överstigande 50 %) med konvexa, semiopaka, rĂ„a och fĂ€rglösa kolonier. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn.

Ett bra anrikningssubstrat saknas för Shigella men Selenit-buljong kan anrika sÀrskilt Sh. sonnei (Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat).

Isolering

PrimÀr utodling: Provmaterial pÄ provtagningspinnen stryks ut pÄ XLD-agar och DC-agar och sekundÀrstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C - 37 °C. XLD-plattan avlÀses efter ett dygn samt DC-plattan efter ett och tvÄ dygn.

Anrikning och sekundÀr utodling: Anrikning av Sh. sonnei kan förekomma nÀr Selenit-buljong anvÀnds. (Anrikningsförfarandet ingÄr dock inte i referensförfarandet för Shigella-diagnostiken.) Provtagningspinnen stoppas efter den primÀra och sekundÀra utstrykningen ned i buljongen och inkuberas över natt i 35 °C - 37 °C. Med plastinös görs dÀrefter utstryk pÄ XLD-agar. Plattorna inkuberas vid 35 °C - 37 °C över natt och avlÀses.


Identifiering och minimikriterier

Presumtiv diagnos: PÄ XLD-agar vÀxer Shigella-bakterier inom ett dygn med semiopaka, slÀta och blanka fÀrglösa 0,2-2 mm stora kolonier. SÀrskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation, varvid rÄa kolonier med ojÀmna kanter kan förekomma.

PĂ„ DC-agar enligt Hynes vĂ€xer Shigella inom tvĂ„ dygn (ca 1/3 av stammarna har inte vĂ€xt ut efter 1 dygn) med semiopaka, slĂ€ta eller rĂ„a, fĂ€rglösa (ibland rosa/röda opaka, Shigella dysenteriae typ 1 kan vara rödlila). Centralt upphöjda (”stekt Ă€gg”) kolonier förekommer.

MisstÀnkta kolonier plockas, rensprids pÄ MacConkey-agar och identifieras med testbatteri enligt Tabell 10 efter vÀxt över natten i 35°C - 37°C. Testbatteriet definieras i artikeln Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener.

Testbatteriet inkuberas över natten i 35°C - 37°C. Resultatet avlÀses och tolkas enligt tabell 10.

Tabell 10. Biokemiska referenssubstrat och förvÀntade resultat efter inkubering i 35-37 °C vid identifiering av Shigella-bakterier

Bakterie Mannit 1) LD 2) OD 3) H2S 2) ONPG Indol 4) Urea 2)
Shigella sonnei +/0 gas - + - + - -
Shigella boydii +/0 gas - - - + - -
Shigella boydii/flexneri +/0 gas - - - - + -
Shigella boydii/flexneri, variant +/0 gas - - - - - -
Shigella dysenteriae - - - - + - -
Shigella dysenteriae, variant 1 - - - - - + -
Shigella dysenteriae, variant 2 - - - - - - -
  • 1) Mannit utan gas i Durhamrör. Enstaka stammar av Sh. boydii och Sh. flexneri kan jĂ€sa mannit under gasutveckling. Enstaka stammar av Sh. flexneri, Sh. boydii och Sh. sonnei Ă€r negativa i mannit.
  • 2) Positiv reaktion i endera LD, H2S, urea eller oxidas utesluter genus Shigella.
  • 3) Enstaka isolat av Sh. boydii och Sh. flexneri kan vara OD-positiva. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara OD-negativa.
  • 4) Positiv reaktion i bĂ„de ONPG och indol utesluter i praktiken genus Shigella. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara ONPG-negativa.


Bakterier som pÄ omstrykningen har en för Shigella typisk kolonimorfologi och som jÀser enligt nÄgot av utfallen i tabell 10 misstÀnks vara Shigella. JÀsning av glukos Àr ett minimikriterium för presumtiv identifiering av Shigella. JÀsning av glukos kan normalt avlÀsas i LD-röret genom fÀrgomslag till gult.

Ett isolat som avviker i mer Àn en reaktion (enligt fotnot 1-4 tabell 10) kan i praktiken uteslutas frÄn genus Shigella.

Isolat som misstÀnks vara Shigella karakteriseras ytterligare med ett kommersiellt testsystem (t.ex. API 20E). KvarstÄr dÀrefter misstanke om Shigella, sÀnds isolatet till FolkhÀlsomyndigheten för identifiering och typning.

Slutlig diagnos: För identifiering av Shigella krÀvs förutom testerna i den primÀra identifieringen att stammen Àr negativ i rörlighet och VP. Vidare krÀvs att bakterier avdödade genom kokning i 2 timmar agglutinerar i monospecifikt antiserum. Anledningen till att agglutinationen skall göras pÄ kokta bakterier Àr förekomst av ett antal korsreaktioner, med frÀmst E. coli dÀr olika proteinantigener Àr ansvariga. Dessa förstörs genom kokning.

Vid ett konsensusmöte om fecesdiagnostik i april Är 2002 beslutades att alla invasiva bakterier i grÄzoonen mellan Shigella och EIEC, d.v.s jÀser som Shigella, har virulensplasmiden men som inte agglutinerar i specifikt antiserum efter kokning, skall betraktas som EIEC och inte som Shigella.

Det Àr lÀmpligt att FolkhÀlsomyndigheten t.v. handhar den slutliga identifieringen av Shigella dÄ de samlade erfarenheterna vid FolkhÀlsomyndigheten, i samarbete med internationella referenslaboratorier, kan komma att pÄverka framtida klassificering av Shigella, och att stammarna dÄ finns tillgÀngliga för typning.

Avvikelser frÄn referensmetodiken

Referensmetodiken anger en miniminivÄ för diagnostiken. Avvikelser frÄn referensmetodiken mÄste valideras mot denna och dokumenteras.


Alternativ diagnostik

Shigella-liknande bakterier, hÀr definierade som bÄde Shigella och EIEC, kan med god sÀkerhet och med stor kÀnslighet identifieras genom pÄvisande av virulensplasmiden i ett fecesprov. Vid FolkhÀlsomyndigheten görs detta genom att utodla feces pÄ en MacConkey-platta och dÀrefter analysera utvÀxta kolonier med PCR.


ResistensbestÀmning och resistensutveckling

Även om flertalet Shigella-infektioner lĂ€ker ut spontant antibiotikabehandlas mĂ„nga patienter med god effekt. Behandling förkortar ocksĂ„ smittsamhetsperioden. Utveckling av multiresistens har noterats frĂ€mst i Sydostasien. Shigella-bakterier skall dĂ€rför resistensbestĂ€mmas. Rekommendationen följer aktuell metodik utarbetad av RAF.


Epidemiologisk typning

FolkhÀlsomyndigheten utför rutinmÀssigt en begrÀnsad serologisk typning av Shigella. Detta Àr sÀrskilt viktigt vid misstanke om utbrott och inhemsk smitta. Vid behov kompletteras denna genom typning med bl.a. DNA-baserad metodik.

Kvalitetskontroll och metodkalibrering

Utförs efter de principer som anges under kvalitetssÀkring i den allmÀnna delen

Referensstammar

I tabell 11 listas referensstammar av Shigella

Tabell 11. Shigella referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer.

Bakterie CCUG ATCC Karakteristika VÀxt (1) pÄ XLD VÀxt (1) pÄ DC-Hynes
Shigella flexneri 21 251 - indolpositiv >75 >75
Shigella flexneri 32 079 12 022 normalvariant >75 >50
Shigella sonnei 32 351 25 931 normalvariant <25 <25
Shigella sonnei 9567 9774 normalvariant <25 <10
VÀxt pÄ 1)

1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s antal CFU pÄ testagar x100/antal CFU pÄ kontrollagar (CLED eller MacConkey), se ocksÄ avsnitt substratprövning, bilaga 1.2.

Referenssera

  • Sh. dysenteriae 1-13 (Reagensia AB)
  • Sh. flexneri (Reagensia AB)
  • Sh. flexneri monoklonaler (Reagensia AB)
  • Sh. boydii 1-18 (Reagensia AB)
  • Sh. sonnei SoR (Reagensia AB)

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Vid stark misstanke om Shigella kan ett preliminÀrsvar om vÀxt av misstÀnkt Shigella anges, samt att isolatet sÀnts till FolkhÀlsomyndigheten för verifiering. Efter erhÄllet svar meddelas detta till inremitterande med angivande av species samt i förekommande fall serotyp. Resistensmönster mot antibiotika skall bifogas preliminÀrsvaret.