Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA

Hoppa till: navigering, sök

Sida under bearbetning april 2012. InnehÄllet Àr preliminÀrt i vÀntan pÄ konsensusförfarande


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)


spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA

Bakgrund

Vid spa-typning analyseras genom sekvensering den variabla regionen X i protein A genen (spa). Genen finns hos alla bakterier av arten S. aureus och kodar för protein A pÄ cellytan. X-regionen bestÄr av ett variabelt antal basparsrepetitioner flankerat av vÀl konserverade regioner. spa-typning drar nytta av tekniska fördelar som snabbhet och reproducerbarhet och den Àr ocksÄ pÄ ett enkelt sÀtt kommunicerbar. Typning Àr enkel men krÀver apparatur för DNA-sekvensering.

Det finns en internationellt erkĂ€nd nomenklatur dĂ€r resultatet av spa-typning uttrycks enligt ett system som utarbetats vid universitetet i MĂŒnster i Tyskland och som nu anvĂ€nds i mĂ„nga lĂ€nder i Europa och andra delar av vĂ€rlden. För Ă€ndamĂ„let finns en vĂ€l underhĂ„llen internetbaserad global databas (SpaServer database, RidomSpaServer.ridom.de) som underlĂ€ttar det epidemiologiska arbetet och möjliggör ocksĂ„ jĂ€mförelser mellan lĂ€nderna.

Mellan Ären 2000 till 2005 typades vid SMI alla insÀnda isolat av MRSA med PFGE och en nationell databas byggdes upp. Sedan 2006 anvÀnds spa-typning som primÀr typningsmetod för MRSA. I vissa sammanhang, framför allt i samband med internationella jÀmförelser av isolat, bÄde inom och utom Europa, kan Àven en annan typningsmetod, sÄ kallad multi locus secquence typing, (MLST), anvÀndas. För att sÀkrare kunna kartlÀgga ett utbrott, framförallt med de vanligaste spa-typerna, Àr komplettering med PFGE fortfarande anvÀndbar.

I Sverige Ă€r spa-typerna t008, t002 och t019 vanligast med över 100 isolat vardera under Ă„r 2011. De tio vanligaste typerna stĂ„r för cirka 50 % av de svenska fallen.

Utförande

Nedan visas översiktligt hur en spa-typning gÄr till. För utförandet behövs PCR-instrument, sekvenseringsinstrument och programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH).

UtgÄngsmaterial Àr renkultur av S. aurues pÄ agarplatta. DNA extraheras med gÀngse metodik. Vanligen anvÀnds lysostaphin i rumstemperatur följt av proteinase K vid 56° C. dÀrefter inkuberas provet 15 min. 95° C varefter templatet spÀs 1/100 i vatten.

Nukleinsyraamplifiering görs med följande primrar

  • Primer SPA 1113f sekvens; 5’ TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C 3’
  • Primer SPA 1514r sekvens; 5’ CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT 3’

Mix/PCR-rör

  • Mastermix för 24 prov
    • 24 ”L, 10 pmol/”L SPA 1113f
    • 24 ”L, 10 pmol/”l SPA 1514r
    • 120 ”L, reaktionsbuffert x 10 Taq enzym dilution
    • 6 ”L, 5U/”l Taq DNA polymeras
    • 96 ”L, 10mM dNTP/dUTP mix (Fermentas)
    • 72 ”L, 30 mM MgCl2
    • 615 ”L destillerat sterilt DNase och RNase fritt vatten


Till varje PCR-kapillÀrrör sÀtts 10 ”L fÀrdigberett templat 10 pg/”L.

PCR-program för amplifiering av nukleinsyra

  • 10 min 80°C
  • 35 cycler omfattande 45 sek 94°C, 45 sek 60°C och 90 sek 72°C
  • programmet avslutas med en cycel 10 min 72°C.


PCR-produkt renas dÀrefter frÄn ej inkorporerade primrar och dNTP. Exempelvis kan QIAquick PCR purification Kit anvÀndas enligt tillverkarens rekommendationer.

Sekvensering av PCR-produkten

  • InmĂ€rkning görs i 0,2 mL microrör
    • 4 ”L Primer SPA 1113f
    • 4 ”L BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit 1.1 (Life technologiesTM)
    • 2 ”L reaktionsbuffert
    • 3 ”L mĂ„l-DNA (PCR-produkt frĂ„n ovanstĂ„ende reaktion)
    • 7 ”L vatten


PCR-programmets utformning vid inmÀrkning för sekvensering

  • 25 cycler; 15 sek 96°C, 10 sek 50°C och 4 min 60°C dĂ€refter 5 sek 60°C och 60 sek 15°C

InmĂ€rkt PCR-produkt renas dĂ€refter inför sekvenseringen. I ett första steg fĂ€lls den inmĂ€rkta produkten med NaAc och 95 %-ig etanol och vĂ€rms i 90°C. Efter centifugering tvĂ€ttas pelleten i 70%-ig etanol som avlĂ€gsnas, i ett sista steg, genom indunstning vid 90°C. Den nu renade produkten blandas med formamid, centrifugeras, vĂ€rms i 90°C och stĂ€lls sedan kortvarigt pĂ„ frysblock. DĂ€refter överförs produkten till ett sekvenseringsrör.

Analys av sekvenseringsresultatet

Det vid sekvenseringen erhÄllna resultatet (som repeat-följd) överförs i programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH) och den aktuella stammen erhÄller pÄ sÄ sÀtt en spa-typ.

REFERENSER

  • 1. FrĂ©nay HM et al. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphism. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1996 Jan;15(1):60-64
  • 2. Stefani S et al. Methicillin-ersistnat Staphylococcus aureus (MRSA): global epidemiology and harmonisation of typning methods. Int J Antimicrob Sgents. 2012 Apr;39(4):273-82
  • 3. Harmsen D., Claus H., Witte W., RothgĂ€nger J., Claus H., Turnwald D., & Vogel U. 2003). Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting using a novel software for spa-repeat determination and database management. J. Clin. Microbiol. 41:5442-5448.