Strand Displacement Amplification (SDA)

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:MolekylÀrbiologisk diagnostik


Strand Displacement Amplification (SDA)

SDA-tekniken Ă€r en mĂ„lbaserad isotermal amplifieringsmetod och ett alternativ till PCR i ett kommersiellt system (figur16). SDA-metoden anvĂ€nds framförallt för detektion av Chlamydia trachomatis och Neisseria gonorrhoeae, men den anvĂ€nds Ă€ven för specifik detektion av Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila och Mycobacterium tuberculosis i samma system. Denaturering sker endast en gĂ„ng i början av processen. Metoden Ă€r enzymatisk vilket gör att inga temperaturvĂ€xlingar behövs och att hela processen kan utföras vid 52 °C. SDA kan beskrivas med tre delmoment; generering av mĂ„l-DNA kopia, exponentiell SDA-amplifiering och detektion. Metoden baseras pĂ„ förmĂ„gan hos DNA-polymeraset att initiera DNA-replikation (kopiering) vid ett brott i enkelstrĂ€ngat DNA, samtidigt som det ersĂ€tter nukleotider i den uppbrutna strĂ€ngen (eng. nick translation). Den ersatta, nya, enkelstrĂ€ngen av DNA anvĂ€nds sedan som substrat dĂ„ reaktionen fortsĂ€tter med primerinbindning, klyvning och replikation. Öppningen (brottet) i den enkelstrĂ€ngade DNA-molekylen produceras av ytterligare ett enzym, ett restriktionsendonukleas.

De startsekvenser, primers, som anvĂ€nds i reaktionen har en mĂ„lspecifik region pĂ„ 15-20 baspar. Med hjĂ€lp av tvĂ„ primerpar skapas först en kopia av mĂ„l-DNA sekvensen. DĂ„ det ena primerparet innehĂ„ller en specifik sekvens som kĂ€nns igen av restriktionsenzymet BsoB I, kommer den nya DNA-kopian att innehĂ„lla klyvningsomrĂ„det för BsoB I. Genom att anvĂ€nda modifierade cytosin (dCTPïĄS) under amplifieringsprocessen hindras restriktionsenzymet frĂ„n att klippa dubbelstrĂ€ngat. Restriktionsenzymet introducerar en enkelstrĂ€ngad öppning frĂ„n vilken polymeraset initierar DNA-replikering och skapar en kopia. Eftersom polymeraset saknar exonukleasaktivitet ”knuffas” framförliggande DNA bort som en hel DNA-strĂ€ng (ny kopia). Restriktionsenzymet kan Ă„terigen klyva och polymeraset kopierar om och om igen. Varje ny kopia kan agera som templat för vidare hybridisering, elongering och restriktionsklyvning.

ErsĂ€ttning av den öppnade strĂ€ngen sker i bĂ„da riktningar vilket ger en exponentiell amplifiering av mĂ„lsekvensen. De amplifierade produkterna detekteras med hjĂ€lp av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), dĂ€r en fluorescerande detektorprobe inmĂ€rkt med tvĂ„ olika fluorescerande molekyler, ”reporter” och ”quencher”, anvĂ€nds. Proben har en ”hĂ„rnĂ„lsstruktur” och den binder till en specifik del av mĂ„l-DNA-sekvensen. Proben har Ă€ven den sekvens som kĂ€nns igen av restriktionsenzymet. Polymeraset förlĂ€nger proben som dĂ€refter kopieras och rĂ€tas ut till dubbelstrĂ€ngat DNA. DĂ„ proben klyvs separeras de tvĂ„ fluoroforerna, vilket gör att fluorescensen frĂ„n reportern inte lĂ€ngre slĂ€cks ut, utan maximeras. Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescenslĂ€sare och analyseras.


Figur 16 (1-8). Strand Displacement Amplification Bild: Copyright Becton Dickinson, http://www.bd.com

1. En enkelstrÀngad (guldfÀrgad) DNA-molekyl binder tvÄ primers (blÄ med klyvningsekvens för restriktionsenzymet i rött) och tvÄ DNA-polymeraser (gul).
2. Primrarna elongeras, förlÀngs, varvid den frÀmre strÀngen trÀngs undan och ersÀtts.
3. Den frigjorda enkelstrĂ€ngade DNA-molekylen Ă€r en kopia av ”mĂ„l-DNA” och innehĂ„ller klyvningssekvensen för restriktionsenzymet.
4. Den komplementÀra primern binder till den enkelstrÀngade kopian, elongering startar och den dubbelstrÀngade DNA-molekylen kan nu klyvas av restriktionsenzymet (triangel).
5. Restriktionsenzymet gör ett enkelstrÀngat brott, varifrÄn polymeraset initierar DNA- replikering.
6. Elongering resulterar i en kopia som frigörs (blÄ) samtidigt som ytterligare en dubbelstrÀngad DNA-molekyl produceras (som i steg 4).


7. De frigjorda strĂ€ngarna frĂ„n steg 6 binder till en detektorprobe som innehĂ„ller en ”reporter” (grön) och en ”quencher” (röd).
8. Polymeraset förlĂ€nger proben, som rĂ€tas ut och klyvs av restriktionsenzymet. NĂ€r ”reportern” och ”quenchern” separeras kan en ökning av fluorescenssignalen detekteras.