Tuberkulos och mykobakterios-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Artikeln uppdaterad januari 2010


Huvudartikel: Tuberkulos (tidigare Referensmetodik:Mykobakteriologisk diagnostik)

och

Atypiska mykobakterier



Laboratoriediagnostik av tuberkulos och mykobakterios

AllmÀnt

Referensmetoden för pÄvisande av mykobakterier inkl M. tuberculosis-komplexet Àr odling. Det Àr viktigt att erhÄlla isolat för resistensbestÀmning och epidemiologisk typning. Odling av mykobakterier tillhörande M. tuberculosis-komplexet krÀver sÀkerhetslaboratorium med skyddsnivÄ 3 enligt gÀllande föreskrifter frÄn Arbetsmiljöverket. PÄ grund av mykobakteriernas lÄngsamma tillvÀxt rekommenderas mikroskopi och nukleinsyrapÄvisning som viktiga komplement för snabbare diagnostik.

Referensmetodik

Odling

Odlingsförfarandet Àr utformat sÄ att vÀxt av bÄde MTB och icke tuberkulösa mykobakterier (NTM) gynnas.

Referenssubstrat: Löwenstein-Jensen (LJ) Àggbaserat fast medium med glycerol eller natriumpyruvat (se Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept). Alternativt kan Middlebrook agar anvÀndas men det anvÀnds traditionellt inte i Sverige för rutindiagnostik. För flytande odling finns kommersiella Middlebrook-buljonger. För optimal kÀnslighet rekommenderas odling pÄ minst ett fast och ett flytande medium.

Homogenisering, dekontamination och koncentrering: Prov som normalt Àr kontaminerade med normalflorans snabbvÀxande bakterier (t.ex. sputum) dekontamineras och digereras med NALC(N-acetyl-L-cystein)-NaOH metoden enligt nedan. Andra vanligt förekommande dekontamineringsmetoder som t. ex Natriumlaurylsulfatmetoden anses ge sÀmre kÀnslighet.


Enligt Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI):

  • NALC och NaOH, Reagens
    • A. 4% NaOH ----- 500 mL
    • B. 2.9 % natriumcitrat dihydrat eller 2.6 % vattenfri natriumcitrat ----- 500 mL
    • C. NALC (tillverka dagligen) ----- 5 g
    • D. pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten)


Blanda A och B, sterilisera och förvara för anvÀndning senare. TillsÀtt reagens C strax innan anvÀndning. Förbrukas inom 24 timmar.

  • 1. För över 5-10 mL prov till ett 50 mL centrifugrör.
  • 2. TillsĂ€tt motsvarande volym av NALC-NaOH-lösningen
  • 3. Skaka röret 5-20 sekunder med Vortex
  • 4. LĂ„t stĂ„ i 15 min
  • 5. TillsĂ€tt steril pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten) till 50 mL-markeringen, skruva Ă„t korken och blanda innehĂ„llet genom att vĂ€nda pĂ„ röret
  • 6. Centrifugera vid 3000 x g i 15 min.
  • 7. HĂ€ll eller sug omedelbart av supernatanten.
  • 8. Resuspendera pelleten i 1-2 mL saltlösning eller fosfatbuffert.
  • 9. Blanda försiktigt och inokulera pĂ„ odlingsmedia och preparatglas. Om inokulering pĂ„ odlingsmedia försenas resuspendera i 0,2 % BSA fraktion V istĂ€llet för vatten eller saltlösning.


Om man endast har tillgÄng till centrifug för 10 mL rör kan en mindre mÀngd tillsatt prov (1-2 mL) accepteras.


Kontaminerade prov i större mÀngd (t.ex. urin, ventrikelsköljvÀtska): Proven bör centrifugeras, helst i 50 mL rör. I vissa fall kan t.ex. 5 x 10 mL rör anvÀndas.

FrÄn bottensatsen överförs 1-2 mL till centrifugrör, varefter behandling utförs enligt ovan.

KroppsvÀtskor frÄn normalt sterila lokaler; cerebrospinalvÀtska, benmÀrg och blod, dekontamineras inte.


Sputum frÄn CF/PCD-patienter, feces, tarmbiopsier och obduktionsmaterial: tillsÀtt PANTA, 2 droppar/LJ-rör, före inokulering av provmaterialet.

Vid stora mÀngder bör centrifugering ske före odling och ev. behandling.


VĂ€vnad, biopsier:

  • 1. Provet homogeniseras i steril mortel.
  • 2. 1 mL PBS tillsĂ€tts.
  • 3. Skakas i Vortex.


Blod, benmÀrg: För ÀndamÄlet avsedda buljongflaskor för odling av mykobakterier inokuleras med provmaterial.

Isolering

Provmaterialet kan inokuleras och fördelas dels pÄ fast substrat och dels pÄ flytande. Av provmaterialet inokuleras 0,3-0,5 mL pÄ minst ett LJ-rör. Till röret sÀtts vid behov (t ex feces eller prover frÄn CF patienter) en lÀmplig antibiotikakombination för att undertrycka kontaminerande flora, t.ex. PANTA (Polymyxin, Azlocillin, Nalidixin, Trimetoprim, Amfotericin B) (Becton Dickinson). Inkubation sker under 8 veckor i 37 °C.

Prov frÄn ytliga lokaler (sÄr, hud) samt prover frÄn t ex CF patienter inokuleras pÄ ytterligare minst ett rör enligt ovan för inkubation i 30 °C. (för vÀxt av t ex M. marinum och M. abscessus).

Prov inkuberas i Middlebrook-buljong för automatisk odling i t ex MGIT-systemet (Becton Dickinson). Prov frÄn ytliga lokaler, leder, skelett och luftvÀgsprov frÄn CF-patienter kan Àven inokuleras i ett buljongrör som inkuberas i 30 °C och avlÀses manuellt.

CerebrospinalvÀtska förbehandlas inte utan odlas direkt pÄ LJ-rör samt Middlebrook-buljong.

Blod/benmÀrg inokuleras helst direkt vid provtagning i blododlingsbuljong avsedd för mykobakterier, upp till 5 mL av provet.

Supplement som tillhandahÄlls av tillverkaren tillsÀtts pÄ laboratoriet. Lymfocyter i blodet kan ge ett visst utslag som om vÀxt skulle förekomma i buljongen.

AvlÀsning

LJ-rör inspekteras minst varje vecka under 8 veckor. Mikroskopipreparat görs frÄn misstÀnkta kolonier för att konfirmera förekomst av mykobakterier med Ziehl-Neelsen fÀrgning eller AuraminfÀrgning.

Kolonimorfologin varierar mellan arterna och inom arten beroende pĂ„ tillvĂ€xtbetingelserna frĂ„n ‘smooth’ till ‘rough’. Kolonierna kan vara opigmenterade (frĂ„n svagt gulvita) till beige, gula och mera sĂ€llan skĂ€ra till orange. Pigment kan bildas i mörker (skotokromogena) eller endast vid belysning (fotokromogena). TillvĂ€xten Ă€r lĂ„ngsam med generationstider 2-20 tim. Synliga kolonier kan observeras efter ca 2-7 dagar (snabbvĂ€xare) eller 10 dagar - 8 veckor (lĂ„ngsamvĂ€xare). Optimal temperatur för tillvĂ€xt varierar frĂ„n 30 °C (M. marinum) till 45 °C (M. xenopi). De flesta arterna vĂ€xer pĂ„ Middlebrook-buljonger eller Löwenstein-Jensen agar, vissa krĂ€ver tillsats av t ex jĂ€rn (t. ex. M. haemophilum, M. genavense) eller mykobaktin (M. avium subart paratuberculosis).

Buljongodlingssystem som MGIT bygger pÄ (automatisk) detektion av mykobakterievÀxt. Inkubation under 6 veckor Àr standard vid primÀrisolering. Vid vÀxt konfirmeras mykobakterier med mikroskopi enligt ovan, samt odlas ut pÄ LJ substrat.


Identifiering och minimikriterier

Mycobacterium tuberculosis-komplexet

VĂ€xt av (oftast) cordbildande syrafasta bakterier pĂ„ LJ-substrat eller Middlebrook-buljong. Positiv DNA-hybridisering pĂ„ odlingsisolatet eller tidigare positiv nukleinsyrapĂ„visning i provet. M. tuberculosis Ă€r normalt in vitro resistent mot tiophen-2-carboxylsyrahydrazid (TCH) 5 mg/L och kĂ€nslig för pyrazinamid, Ă€ven om avvikelser (TCH =S) eller (PZ = R) förekommer. Även biokemiska tester som nitratreduktion eller niacinproduktion (M. tuberculosis Ă€r positiv i bĂ„da) förekommer.

M. bovis Àr alltid TCH-kÀnslig och PZ-resistent.

Konfirmering av M. bovis och M. bovis-BCG bör ske med molekylÀra metoder t ex spoligotypning (FolkhÀlsomyndigheten), eller med ett diagnostiskt kit, som med PCR/omvÀnd hybridisering kan pÄvisa M tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum I m.fl. (Genotype, Hain Lifescience).

Icke-tuberkulösa mykobakterier, NTM.

VÀxt av (oftast) icke-cordbildande syrafasta bakterier pÄ LJ eller Middlebrook-substrat. ArtbestÀmning sker frÀmst med diagnostiska kit (PCR/omvÀnd hybridisering eller 16S sekvensering).


Övriga diagnostiska metoder

Mikroskopi

Mikroskopisk undersökning av sputum Ă€r en snabb, enkel och specifik diagnostisk metod som kan diagnosticera flertalet fall av smittsam lungtuberkulos. Det krĂ€vs dock ca 10.000 mykobakterier per mL sputum för positivt resultat, varför mikroskopi inte Ă€r tillrĂ€ckligt kĂ€nsligt för diagnostik av mykobakterie-förekomst, utan bör alltid kompletteras med odling och eventuellt nukleinsyrapĂ„visning. AuraminfĂ€rgning för fluorescensmikroskopi eller Ziehl-Neelsen fĂ€rgning för ljusmikrokopi Ă€r de vanligaste förekommande metoderna. FĂ€rgen kan inte avlĂ€gsnas med syra-alkohol, vilket gett upphov till beteckningen ‘syrafasta bakterier’. Syrafastheten kan delvis gĂ„ förlorad i vissa faser av tillvĂ€xt, och Ă€r inte sĂ€llan partiell pĂ„ snabbvĂ€xande icke-tuberkulösa mykobakterier.

Vid fluorescensmikroskopi ser man ett större synfÀlt varför avlÀsningen gÄr snabbare och kÀnsligheten Àr ocksÄ nÄgot högre. Metoden rekommenderas dÀrför i första hand för undersökning av direktpreparat. Vid ljusmikroskopi efter Ziehl-Neelsen fÀrgning anses man bÀttre kunna se bakteriernas morfologi, varför metoden har rekommenderats för konfirmering av positiva direktpreparat samt för undersökning av preparat frÄn odlingsisolat. Betydelsen av detta förfarande har sannolikt minskat i takt med introduktionen av molekylÀra metoder för artidentifiering varför endast fluoroscensmikroskopi torde vara tillrÀckligt i de flesta fall.

Smittsamhetsbedömning görs med mikroskopi av sputum, och Ă€r naturligen av störst intresse före behandling, men kan ocksĂ„ ge indikation pĂ„ Ă„terfall om bakterieantalet ökar kraftigt under behandling. Sensitiviteten jĂ€mfört med odling Ă€r ca 25 % om inte anrikat sputum anvĂ€nds och ca 50 % om sputum förbehandlas och centrifugeras. Specificiteten Ă€r vanligen > 99 %.

Man kan inte med mikroskopi differentiera mellan M. tuberculosis-komplexet och NTM. NukleinsyrapÄvisning bör utföras för MTB vid fynd av syrafasta bakterier i luftvÀgssekret för att klarlÀgga om det rör sig om TB eller NTM.

OBS att risken för kontamination av provet med ovidkommande mykobakterier bör beaktas. KÀllor för kontamination kan vara t.ex. kranvatten, (M. gordonae m.fl.), fÀrgvÀtskor och immersionsolja.

  • Homogenisering av prov: Prov bör homogeniseras och koncentreras med centrifugering >3000 x g för att öka sensitiviteten av mikroskopi och odling. Viskösa prov görs flytande genom förbehandling (se ovan under primĂ€risolering).
  • CLSI: Utstryk och fixering: Utstryk prepareras pĂ„ vanligt sĂ€tt och fixeras genom upphettning med gaslĂ„ga tre gĂ„nger eller i 65 - 75 °C i minst 2 timmar pĂ„ en elektrisk preparatvĂ€rmare. FluorescensfĂ€rgning med auramin: Fixerade preparat exponeras för auraminlösning 15 min. Skölj med vatten. AvfĂ€rga med syra-alkohollösning 2 min. Skölj med vatten. KontrastfĂ€rga med kaliumpermanganat i 2 minuter. Skölj och lufttorka. FĂ€rgning i kyvett rekommenderas inte eftersom det finns en dokumenterad risk för korskontaminering mellan prover. Om det av praktiska skĂ€l inte kan undvikas bör kyvetterna rengöras noga och preparat frĂ„n primĂ€rprover och odlingsisolat fĂ„r inte fĂ€rgas i samma kyvett. Kontaminationsrisken bör beaktas vid avlĂ€sning.

Reagens, se Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept.

Auramin stÄr pÄ Arbetsmiljöverkets lista över carcinogena Àmne varför speciella ÄtgÀrder krÀvs för att hantera och omhÀnderta Àmnet. V g se [1]

AvlÀsning

Screening av preparat kan ske vid lĂ€gst 250 × förstoring (objektiv 20× eller 40×, okular 10-12,5×). BlĂ„ljus frĂ„n 100W Hg-lampa med filterkombination för auramin eller LED illuminator kan anvĂ€ndas. Granska minst 30 synfĂ€lt. AnvĂ€nd större förstoring för att identifiera misstĂ€nkta mykobakterier (”beading” i MTB, se t.ex. ASM-manual). Rekommendation att positiva preparat bedöms av ytterligare en avlĂ€sare alternativt att fĂ€rgning med Ziehl-Neelsen görs.

Kvalitetskontroll

En standardiserad preparatkontroll inkluderas vid varje fÀrgningstillfÀlle. M. gordonae eller annan apatogen mykobakterieart rekommenderas som positiv kontroll och t ex E. coli som negativ.

MolekylÀrbiologiskt pÄvisande

DirektpĂ„visning av M. tuberculosis-komplexet med polymeraskedjereaktionen, PCR, eller liknande molekylĂ€rbiologiska metoder, Ă€r viktiga snabbdiagnostiska metoder, speciellt vid lungtuberkulos. SĂ„lunda visades redan 1993 med PCR sensitivitet 83 % och specificitet 99 % gentemot odling för luftvĂ€gsprov. Samma metoder kan anvĂ€ndas för serösa sekret och Ă€ven vĂ€vnadsprov. SĂ€rskilt i de senare Ă€r bakteriemĂ€ngden ofta lĂ„g och inhibitorer kan störa reaktionen, varför sensitiviteten Ă€r lĂ€gre.

Eftersom icke viabla bakterier kan pÄvisas med PCR kan odlingsnegativa prov vara sant PCR-positiva. Stabiliteten hos DNA möjliggör detektion av DNA frÄn M. tuberculosis komplex i formaliniserade prov och Àven i t.ex. luftvÀgsprov efter insatt tuberkulosbehandling.

Sensitiviteten för mikroskopipositiva prov Ă€r ca 95-100 % jĂ€mfört med odling. För mikroskopinegativa prov Ă€r sensitiviteten ca 50- 60 % jĂ€mfört med odling. Specificiteten Ă€r 99-100 %. Negativ PCR utesluter sĂ„ledes inte tbc! Inhibitorer i sekret och vĂ€vnader kan minska sensitiviteten i PCR. Sköljning av materialet med PBS kan avlĂ€gsna inhiberande substanser (detta behövs ej för NALC-NaOH förbehandling). Även i likvor finns inhibitorer varför spĂ€dning och centrifugering bör ske men hellre bör andra DNA-preparationsmetoder rekommenderas.

PCR-tekniken Àr krÀvande trots att utmÀrkta kits finns pÄ marknaden. Strikta rutiner behövs för att hindra kontamination av laboratoriet med amplifierat material. PCR bör endast utföras i laboratorier som har resurser för samtidig mykobakterieodling, sÄ att kontinuerlig jÀmförelse av resultaten kan ske. Slutlig bakteriologisk diagnostik med differentiering inom M. tuberculosis-komplexet kan för nÀrvarande inte ske utan odling. ResistensbestÀmning sker heller vanligen inte utan odling.

ResistensbestÀmning av MTB-komplexet

Stammar av MTB som inte utsatts för tb-lĂ€kemedel Ă€r kĂ€nsliga för dessa. Dock föreligger en spontan mutationsfrekvens pĂ„ 10^-^7- 10^-^8, för olika lĂ€kemedel. Resistensutveckling i bakteriologisk mening uppkommer genom selektionstryck vid inadekvat terapi, varvid den resistenta mutanten snabbt kommer att dominera. Samlad klinisk erfarenhet av tbc-behandling har visat att denna blir effektiv om frekvensen resistenta mutanter i bakteriepopulationen understiger 1 % för vart och ett av de ingĂ„ende medlen. För praktiskt bruk tillĂ€mpas dĂ€rför grĂ€nsen 1 % vid in vitro resistensbestĂ€mning för tuberkulostatika. Följande medel Ă€r förstahandsval: isoniazid, etambutol, rifampicin (Ă€ven rifabutin) och pyrazinamid. ResistensbestĂ€mning mot andra- och tredjehandspreparat liksom MIC-utförs, nĂ€r sĂ„ önskas, vid referenslaboratoriet vid FolkhĂ€lsomyndigheten.

För att snabbt erhĂ„lla ett preliminĂ€rt resultat för rifampicin- och isoniazidresistens gĂ€llande M. tuberculosis-komplexet kan molekylĂ€rbiologisk pĂ„visning utföras med kommersiellt kit (t ex HAIN). KĂ€nsligheten att detektera INH-resistens Ă€r ca 90 % och för rifampicin 95-98 %. Resultaten ska dock konfirmeras vid positiv odling i samband med sedvanlig resistensbestĂ€mning.

MGIT

ResistensbestÀmning av M. tuberculosis-isolat mot isoniazid (INH), rifampicin samt etambutol kan utföras i flytande medium, MGIT-rör, med fluorescensindikator. BACTEC MGIT 960 SIRE Kit Àr ett kvalitativt test som tar 4-13 dygn. BACTEC MGIT 960 PZA kit för resistensbestÀmning mot pyrazinamid (PZA) tar 4-21 dygn. Testen bygger pÄ jÀmförelse av M. tuberculosis-isolatets tillvÀxt med och utan antibiotika. Kolonier utvuxna pÄ fast substrat eller vÀxt i MGIT-rör kan anvÀndas som inokulat. Instrumentet indikerar att resistensbestÀmningen Àr klar att tolkas nÀr signifikant vÀxt Àr uppmÀtt i vÀxtkontrollen (inom tillÄten tidsrymd, t ex 4-13 dygn).

Stammar resistenta mot INH och rifampicin (Multidrug-resistant TB, MDR-TB) skickas till referenslaboratorium, FolkhÀlsomyndigheten, för verifiering av resistens samt utvidgad resistensbestÀmning mot de ovan listade preparaten. Isolat som ocksÄ Àr resistenta mot nÄgon fluorokinolon och ytterligare nÄgot av de injicerbara andrahands-eller tredjehandspreparaten benÀmns extensively drug-resistant TB (XDR-TB).

Tabell. Följande testkoncentrationer anvÀnds i MGIT-rören

Preparat	 		Koncentration 
Förstahandspreparat	
Isoniazid			0,1 mg/L		
Isoniazid ^1^)	                0,4 mg/L		
Rifampicin			1 mg/L
Rifabutin			1 mg/L				
Etambutol			5 mg/L			
Pyrazinamid			100 mg/L
Andrahandspreparat	
Amikacin			1 mg/L
Moxifloxacin		        0,25 mg/L		
Ofloxacin			2 mg/L				
Tredjehandspreparat
Kapreomycin			2,5 mg/L		
Etionamid			5 mg/L			
Kanamycin			4 mg/L			
Linezolid			1 mg/L 		
Streptomycin			1 mg/L
Cykloserin^2^)
PAS^2^)
^1^)För isoniazid utförs vid behov MIC – bestĂ€mning (0,5 – 4 mg/L)
^2^)Cykloserin och PAS testas inte i MGIT systemet utan pÄ LJ-medium med den s k proportionsmetoden. 
Brytpunktskoncentrationen Àr 40 resp 1 mg/L för dessa preparat.

ResistensbestÀmning av NTM

ResistensbestÀmning av NTM utförs i regel inte eftersom den kliniska relevansen av ett NTM fynd ofta Àr oklar och att det för flertalet arter och antibiotika inte finns nÄgon dokumenterad korrelation mellan in vitro MIC och klinisk effekt. I följande fall kan dock resistensbestÀmning övervÀgas:

  • Vid infektion med M. avium-komplexet som stĂ„r pĂ„ behandling med klaritromycin (alternativt azitromycin) som sviktar pĂ„ behandling alternativt vid profylaxgenombrott hos HIV patient. I dessa fall bör MIC bestĂ€mning mot klaritromycin utföras.
  • Vid planerad behandling av infektion med vanliga snabbvĂ€xande mykobakterier som t ex M. abscessus, M. chelonae eller M. fortuitum-komplexet.
  • För lĂ„ngsamvĂ€xande NTM finns inte nĂ„gon enskild metod för resistensbestĂ€mning som rekommenderas generellt. För MAC rekommenderar CLSI en buljongbaserad metod som t ex BACTEC 460 (systemet Ă€r dock pĂ„ vĂ€g att utfasas under 2010) eller mikrotiterspĂ€dning. För övriga lĂ„ngsamvĂ€xande NTM kan bĂ„de fast och flytande medium anvĂ€ndas men mĂ„ste valideras och kvalitetssĂ€kras för varje metod och species.

För snabbvÀxande NTM rekommenderar CLSI MIC-bestÀmning med mikrotiterspÀdning. Agartest inklusive E-test rekommenderas ej.

BetrÀffande rekommenderade medel för resistensbestÀmning för respektive art hÀnvisas till Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B, et al. An official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases, American Thoracis Society Documents. Am J Respir Crit Care Med. 2007;Vol 175: 367-416.

För icke-tuberkulösa mykobakterier Àr det önskvÀrt om möjligt att alla arter som resistensbestÀms Ätföljs av en ATCC-stam av samma art. DÄ det rör sig om fÄ isolat Àr det lÀmpligt att ev resistensbestÀmning utförs pÄ laboratorier med erfarenhet av resistensbestÀmning av NTM.

Epidemiologisk typning

MolekylÀrepidemiologisk typning av M. tuberculosis-komplexet sker för att kartlÀgga smittkedjor och uppkomna kluster av tuberkulosfall. För detta sÀnds vÀl utvuxna förstagÄngsisolat frÄn varje patient pÄ fast substrat till FolkhÀlsomyndigheten.

Isolat erhÄllna vid behandlingssvikt, recidiv eller befarad reinfektion bör ocksÄ undersökas. Förutom patientens ID, provtagningsdatum, och provets ID, bör Àven provmaterial, resultat av mikroskopi och resistensbestÀmning meddelas, enklast genom att skicka med en kopia av laboratoriets slutsvar.

För nÀrvarande utgör RFLP (restriktions-fragment-lÀngd-polymorfism) referensmetodik för molekylÀrepidemiologisk typning, men alternativa PCR-baserade typningsmetoder (frÀmst spoligotypning och MIRU-VNTR) utvÀrderas som komplement till eller ersÀttning av RFLP.

Resultaten av RFLP för ett isolat redovisas som graden av identitet (ID) med den befintliga RFLP-databasen eller med ett givet prov:

  • 100 % ID: stammarna tillhör ett kluster, epidemiologiskt samband Ă€r sannolikt.
  • >90 % ID: epidemiologiskt samband kan inte uteslutas.
  • <90 % ID: unikt mönster, inget epidemiologiskt samband.

Vid förekomst av < 5 band i RFLP kompletteras undersökningen med spoligotypning. Vid identiskt spoligotypningsmönster anses stammarna tillhör ett kluster.

Information om RFLP-resultat meddelas till:

  • InsĂ€ndande laboratorium,
  • FolkhĂ€lsomyndigheten, enheten för epidemiologi & hĂ€lsoekonomi, som meddelar
  • vederbörande smittskyddslĂ€kare,
  • som kontaktar vederbörande kliniker i fall av klusterbildning.

Om flera smittskyddslÀkare involveras samordnar Statsepidemiologen utredningen.

Kvalitetskontroll

  • Referensstammar enl CLSI för kvalitetskontroll av odlingsmedium:
    • M. tuberculosis ATCC 25177
    • M. kansasii ATCC 12478
    • M. fortuitum ATCC 6841

BCG, stam Copenhagen, BCG-vaccin, Statens Serum Institut, se FASS.

Svarsrutiner

Direktmikroskopi

Provet rapporteras som positivt i mikroskopi om syrafasta bakterier pÄtrÀffas i preparatet. Antalet bakterier kan vara ett grovt mÄtt pÄ effekten av behandling, men utsöndringen Àr intermittent. DÀrför Àr detaljerad kvantifiering vansklig och förutsÀtter höggradig standardisering.

Förslag till svarsalternativ som dock kan justeras beroende pÄ metod som anvÀnds:

  • 1-9 stavar/preparat : Ange antalet stavar (gĂ€ller andra prov Ă€n luftvĂ€gsprover, bedöm med försiktighet t ex 2 syrafasta stavar, osĂ€kert fynd nytt prov kan rekommenderas, alternativt telefonkontakt)
  • 10-20 stavar/preparat: Sparsam förekomst av syrafasta stavar
  • 1-9 stavar/synfĂ€lt: MĂ„ttlig förekomst av syrafasta stavar
  • >10 stavar/synfĂ€lt: Riklig förekomst av syrafasta stavar


Vid negativt utfall:

  • <10 stavar/preparat (minst 30 synfĂ€lt): Inga syrafasta stavar (gĂ€ller luftvĂ€gsprov) (metodens kĂ€nslighet bör anges som kommentar).

Kommentaren: Odling pÄgÄr. BerÀknad svarstid för denna bör lÀggas till samtliga direktmikroskopiresultat.

NukleinsyrapÄvisning

  • Positiva prov svaras:M. tuberculosis-komplexet DNA PÅVISAT.
  • Negativa prov svaras: M. tuberculosis-komplexet DNA EJ pĂ„visat. (metodens kĂ€nslighet bör anges som kommentar).
  • Prov som innehĂ„ller inhibitorer svaras: Resultatet av DNA-analysen kan inte tolkas p.g.a inhiberande substanser i provmaterialet

Kommentaren: Odling pÄgÄr. BerÀknad svarstid för denna bör lÀggas till.


PreliminÀr resistensbestÀmning

Om preliminÀr resistensbestÀmning utförts med molekylÀrbiologisk metod:

  • PreliminĂ€rt resultat av resistensbestĂ€mning med molekylĂ€rbiologisk metod: INH = kĂ€nslig (alt. resistent), rifampicin=kĂ€nslig (alt resistent) (metodens kĂ€nslighet bör anges som kommentar).
  • Om analysen Ă€r utförd direkt frĂ„n provmaterial kan lĂ€ggas till: Resistensresultat konfirmeras nĂ€r odling blir positiv.
  • Om analysen Ă€r utförd frĂ„n isolat kan lĂ€ggas till: Konfirmerande resistensbestĂ€mning med referensmetod pĂ„gĂ„r.


Odling

Svarsalternativ vid positivt mikroskoperingsresultat frÄn koloni/buljong:

  • Om cordbildande isolat med positivt verifierande resultat i PCR eller omvĂ€nd hybridisering:
    • VĂ€xt av: M. tuberculosis-komplexet , art- och resistensbestĂ€mning pĂ„gĂ„r.
  • Om ej cordbildande eller ej bedömbart om cordbildande:
    • VĂ€xt av: Mykobakterier, artbestĂ€mning pĂ„gĂ„r (Alternativt avvakta artbestĂ€mning innan svar.)


Svara stegvis allteftersom artbestÀmning och resistensbestÀmning Àr klara.

  • Negativ odling svaras:
    • Ingen vĂ€xt av mykobakterier.

Uppmana remitterande lÀkare att rapportera nya fall till smittskyddslÀkare. Klinisk rapportering sker endast för M. tuberculosis-komplexet.

Laboratorierapportering

Alla M. tuberculosis-komplex isolat och alla isolat med icke-tuberkulösa mykobakterier rapporteras via SmiNet av respektive laboratorium.

Infektion med M. tuberculosis regleras av smittskyddslagen (2004:168) - AllmÀnfarliga sjukdomar och infektion med Mycobacterium species av smittskyddslagen - anmÀlningspliktiga sjukdomar utöver allmÀnfarliga sjukdomar. Endast för tuberkulos föreligger smittspÄrningsplikt.

Referensfunktioner

Ej beslutade

REFERENSER

  • Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), Laboratory Detection and Identification of Mycobacteria; Approved Guideline, CLSI document M48-A ([ISBN 1-56238-669-7]) Wayne PA: CLSI; 2008
  • Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B, et al. An official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases, American Thoracis Society Documents. Am J Respir Crit Care Med. 2007;Vol 175: 367-416
  • Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Molecular Diagnostic Methods for Infectious Disease; Approved Guideline – Second Edition. CLSI document MM3-A2. Wayne PA:CLSI; 2006.
  • Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)/NCCLS, Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. CLSI/NCCLS document M24-A. Wayne PA: NCCLS;2003
  • Huard R C, de Oliviera Lazzarina L C, Butler W R, van Soolingen D, Ho L H. 2003. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions. J Clin Microbiol. 41:1637.
  • Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutierrez C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS, Samper S, van Soolingen D, Cole ST. 2002. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 3684-9.
  • Cavanagh R, Begon M, Bennett M, Ergon T, Graham IM, De Haas PE, Hart CA, Koedam M, Kremer K, Lambin X, Roholl P, Soolingen Dv D. 2002. Mycobacterium microti infection (vole tuberculosis) in wild rodent populations. J Clin Microbiol. 40:3281-5.
  • DeBoer A S, Blommerde B, de Haas P E W, Sebek MMGG, et al. 2002. False-positive Mycobacterium tuberculosis cultures in 44 laboratories in the Netherlands (1993-2000): Incidence, risk faktors, and consequences. J Clin Microbiol. 40: 4004-9.
  • Canetti G, Froman S, Grosset J et al. 1963. Mycobacteria:laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull WHO. 29: 565-78.
  • Inderlied C. Antimycobacterial agents: In vitro susceptibility testing, spectrums of activity, mechanisms of action and resistance, and assay for activity in biological fluids. In: Antibiotics and Laboratory Medicine, V Lorian Ed. Williams & Wilkins 1996.
  • Woods G L, Bergmann J S, Witebsky F G et al. 1999. Multisite reproducibility of results obtained by the broth microdilution method for susceptibility testing of Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, and Mycobacterium fortuitum. J Clin Microbiol. 37:1676-82.
  • Inderlied CB, Pfyffer GE. Susceptibility test methods: Mycobacteria. ASM Manual, ASM, Washington, 2003, p 1149-1177.
  • Van Soolingen D et al. 1993. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 31:1987-95.
  • Bauer J et al. 1999. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS 6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark. J Clin Microbiol. 37:2602-6.