Urin-bilaga 1

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: UrinvÀgsinfektioner/bakteriuri, 2:a upplagan 2000


Substratrecept

Urvalet av referenssubstrat i denna gula bok har följt principen att finna medier som effektivast möjligt understödjer vÀxt av beskrivna mikroorganismer. Alla laboratorier mÄste inte nödvÀndigtvis anvÀnda just dessa substrat, Àven om det genom inventerande EQUAS-utskick kan konstateras att sÄ sker i mÄnga fall. De enskilda laboratoriernas substratval följer traditioner baserade pÄ lokala erfarenheter, kunskaper och uppfattningar. Tanken Àr att referenssubstraten dÀrvid skall utgöra valideringsgrund vid det lokala substratvalet. Ett problem vid sÄdana valsituationer Àr att olika fabrikat av ett substrat med synbarligen samma recept (eller olika recept för den delen) kan ha olika egenskaper och fungera mer eller mindre vÀl. Betydande batchvariationer förekommer ocksÄ. Det Àr alltsÄ lÀmpligt att t ex. inför en upphandling jÀmföra angivet referenssubstrat mot en uppsÀttning av alternativa substrat dÀr det förra inte nödvÀndigtvis Àr det som visar sig ha de bÀsta egenskaperna.

För referenssubstraten anges firmanamn och katalognummer för spÄrbarhet till typrecept.

NÀringsberikade fasta substrat för isolering av aeroba och fakultativt anaeroba bakterier (blodagar, hematinagar och CLED-agar)

Till blod- och hematinagar anvÀnds specialkomponerade blodagarbaser som finns kommersiellt tillgÀngliga. I dessa ingÄr ofta skonsamt enzymdigererat kasein som tillhandahÄller peptider och aminosyror med lÄgt kolhydratinnehÄll och bibehÄllen hög halt av tryptofan. Det senare möjliggör test av indolreaktion. Extrakt av köttprotein ger ytterligare aminosyror, vitaminer, spÄrelement etc. Dessa komponenter Àr definierade i US Pharmacopeia. Tillsatt autolysat av bakjÀst bidrar till snabb tillvÀxt och ger substraten goda differentierande egenskaper. MajsstÀrkelse absorberar toxiska metaboliter inklusive fria fettsyror vilket bidrar till sÀker tillvÀxt. Ett generellt problem med blodagarbaser Àr det relativt höga innehÄllet av reducerande kolhydrater vilket negativt pÄverkar den hemolytiska kapaciteten hos betastreptokocker. Columbia blodagarbas enligt Ellner et al (1966) Àr speciellt komponerad för snabb tillvÀxt och differentiering och relationen mellan ingÄende peptoner har avvÀgts sÄ att streptokockernas förmÄga att producera betahemolysin optimerats. Columbia blodagarbas Àr dÀrför lÀmplig som referensbas för blodagar.

Columbiablodagarbas och Blodagarbas II kan anvÀndas som bas för hematinagar (chokladiserad blodagar) avsedd att understödja vÀxt ocksÄ av Haemophilus- och Neisseria-arter. Emellertid utgör traditionellt Carpenter och Johnstons gc-agarbas grundmedium i hematinagar. Denna bas skiljer sig frÄn andra blodagarbaser genom nÄgot mindre agarmÀngd och fosfatbuffring. I kombination med hemoglobin och andra tillvÀxtfaktorer erhÄlls ett mycket nÀringsrikt medium som innehÄller bland annat bundet oxiderat hem (hematin, X-faktor) och NAD (V-faktor). Hematinplattor med Gc-agarbas utgör dÀrmed referenssubstrat, vilka ocksÄ, till skillnad frÄn andra hematinagartyper kan anvÀndas för resistensbestÀmning av gonokocker.


1. Blodagar

Indikation: Substrat anrikat med hÀstblod för isolering av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer samt olika gramnegativa stavar, Neisseria (ej gonokocker), stafylokocker, pneumokocker och streptokocker frÄn kliniska prov.

Princip: Columbia blodagarbas Ă€r ett vĂ€lkomponerat grundmedium med bland annat kaseinhydrolysat och köttextrakt som kvĂ€ve- och kolhydratkĂ€llor avsett att anvĂ€ndas anrikat med 5-10 % valfritt blod. Vanligen anvĂ€nds 5 % defibrinerat hĂ€stblod vilket ger distinkt betahemolys med olika streptokocker, vissa stammar av enterokocker och Listeria. Defibrinerat hĂ€stblod har ringa tendens att chelera metalljoner och ger ofta frodigare kolonier Ă€n om citratblod anvĂ€nds. MĂ„nga fabrikat av Columbia blodagarbas Ă€r inte avpassade för citratblod vilket ocksĂ„ gĂ€ller referenssubstratet. Betahemolys orsakas av hemolys av de röda blodkropparna medan alfahemolys orsakas av att hemoglobinet i helt eller delvis intakta röda blodkroppar reduceras till methemoglobin. För blodagar avsedd för pĂ„visande av betastreptokocker i svalgodlingar brukar istĂ€llet 5-10 % fĂ„rblod rekommenderas, eftersom exempelvis enterokocker ofta inte ger betahemolys pĂ„ sĂ„dant blod. FĂ„rblod tenderar ocksĂ„ att undertrycka normalflora, sĂ€rskilt Haemophilus, mer Ă€n hĂ€stblod. FĂ„rblodplattor kan gjutas dubbelskiktade för att underlĂ€tta avlĂ€sningen.

VĂ€xtkarakteristika: (se tabell 14).

PÄ hÀstblodagar vÀxer de flesta bakteriearter ut inom ett dygn. Kolonistorlek och utseende varierar kraftigt mellan olika arter trots att mediet inte i klassisk bemÀrkelse Àr differentierande. Flera bakteriearter uppvisar alfa- eller betahemolys, den senare med större sÀkerhet om plattorna inkuberas anaerobt. Ett flertal bakterietyper vÀxer svagt eller inte alls pÄ hÀstblodagar. Dit hör bland andra Haemophilus influenzae, Legionella och gonokocker.


  • Recept: (Columbia blodagarbas, Acumedia no 7125)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pankreasdigererat kasein---- 5,0
    • Köttextrakt---- 8,0
    • JĂ€stanrikad pepton--- 10,0
    • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
    • NaCl---- 5,0
    • Agar---- 14,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C


Bered 5 % blodagar genom tillsats av sterilt, defibrinerat hĂ€stblod (alternativt fĂ„rblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.

2. Hematinagar (Chokladiserad blodagar)

Indikation: NÀringsberikat medium för isolering av gonokocker, meningokocker och Haemophilus influenzae frÄn kliniska prov. ResistensbestÀmning av gonokocker.

Princip: Gc-agarbasbaserat medium som nÀringsberikas antingen med hemoglobin (torkat nötblod) och Isovitalex eller med hemolyserat hÀstblod och hÀstserum. Gc-agarbas utnyttjar som mÄnga andra blodagarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt som kvÀve- och kolhydratkÀlla. Reducerad agarmÀngd och fosfatbuffring bidrar till bÀttre och snabbare vÀxt av framförallt gonokocker. Hemoglobin och Isovitalex (liksom lyserat hÀstblod och serum) tillför mediet bland annat X-faktor och V-faktor, en förutsÀttning för vÀxt av H. influenzae, men bidrar ocksÄ till god vÀxt av Neisseria-arter. Hematinagar anvÀnds ocksÄ med tillsats av selekterande antibiotika (Modifierad Thayer-Martin-agar, VCNT-supplement) för isolering av gonokocker frÄn kliniska prov.

VĂ€xtkarakteristika: (se tabell 14).

Meningokocker, gonokocker och Haemophilus vĂ€xer inom ett dygn med ”feta” blanka grĂ„a kolonier, 0,5-2 mm. PĂ„ hematinagar vĂ€xer ocksĂ„ inom ett dygn (ofta med kraftigare vĂ€xt efter tvĂ„ dygn) pneumokocker och streptokocker med tydlig alfahemolys (gĂ€ller inte t.ex. GBS), stafylokocker (vita eller gulgrĂ„a kolonier), Listeria (stora matta platta kolonier) och ett flertal arter av gramnegativa stavar (stora ofta ”rĂ„a” kolonier). Candida albicans vĂ€xer inom ett till tvĂ„ dygn med karakteristiskt ”stjĂ€rn-” formade vita, matta kolonier.


  • Recept: (Gc-agarbas, Acumedia no 7104)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pankreasdigererat kasein---- 7,5
    • Köttextrakt---- 7,5
    • MajsstĂ€rkelse---- 1,0
    • Di-kaliumfosfat---- 4,0
    • Mono-kaliumfosfat---- 1,0
    • NaCl---- 5,0
    • Agar---- 10,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C


Tillred hematinagar genom tillsats av hemoglobinpulver 10 g och IsoVitaleX 10,0 mL enligt tillverkarens anvisningar.


  • Recept: IsoVitaleX (BBL, no 11876)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Vitamin B12---- 0,1
    • L-glutamin---- 10,0
    • Adenin---- 1,0
    • Guanin HCl---- 0,03
    • p-Aminobensoesyra---- 0,013
    • Nikotinamid-adenin-dinukleotid---- 0,25
    • Tiamin pyrofosfat---- 0,1
    • JĂ€rnnitrat---- 0,02
    • Tiamin HCl---- 0,003
    • L-cystein HCl---- 25,9
    • L-cystin----- 1,1
    • D-Glukos---- 100,0

3. Andra beredningsformer av blod- och hematinagar

OvanstÄende agarmedier utgör referenssubstrat. Dock kan andra beredningsformer förekomma pÄ de enskilda laboratorierna. Det Àr dÀrvid viktigt att validera dessa substrat mot referenssubstraten.

Blodagar:

Moderna kommersiella blodagarbaser har ofta goda egenskaper och Àr relativt likvÀrdiga. Alternativ till Columbia agarbas Àr Blodagarbas II. Det skall observeras att sÀrskilt betahemolys kan pÄverkas beroende pÄ vilken bas som vÀljs. Med Blodagarbas II erhÄlls utmÀrkt vÀxt, men betahemolys kan bli odistinkt, dubbel, sÀrskilt med fÄrblod.


  • Recept: (Blodagarbas II, OX0ID, CM 271)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Proteos pepton---- 15,0
    • Digererad lever---- 2,5
    • JĂ€stextrakt---- 5,0
    • NaCl---- 5,0
    • Agar---- 12,0

pH 7,4 ± 0,2 vid 25 °C


Preparera 5 % blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hĂ€stblod (alternativt fĂ„rblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.


Hematinagar:

SÄdan agar kan tillverkas med vilken blodagarbas som helst. Det skall observeras att endast hematinagar baserad pÄ gc-agarbas lÀmpar sig för resistensbestÀmning av gonokocker.

  • Recept: Hematinagar (alternativ för isolering av H. influenzae och Neisseriae)
    • Columbia blodagarbas med tillsats av:
    • HĂ€stblod i lösning---- 8,5 %
    • Normalserum frĂ„n hĂ€st 5-10 %

Tillverkas med chokladisering av blodet.

4. CLED-agar

CLED-agar, blandflora dominerad av E. coli som framtrÀder gulfÀrgade. Foto: Camilla Svensson

Indikation: Referenssubstrat för (i första hand) isolering av urinvÀgspatogener frÄn urinprov, och Enterobacteriaceae vid allmÀn odling.

Princip: CLED Àr en förkortning av Cystein-Lactose-Electrolyt-Deficient utvecklat av Sandys och Mackey. Substratet Àr ickeinhibitoriskt men inte lika nÀringsrikt som blodagar. InnehÄller sÄvÀl kaseinhydrolysat som köttextrakt och understödjer dÀrmed vÀxt av ett stort antal kliniskt relevanta bakterietyper. Karakteristiskt för detta substrat Àr avsaknaden av elektrolyter, vilket hindrar svÀrmning i första hand av Proteus. Mindre selektivt men för övrigt funktionellt nÀra saltfri McConkey-agar. Laktospositiva bakterier blir gula medan laktosnegativa behÄller mediets blÄa grundfÀrg. Kontaminanter frÄn urogenital flora (laktobaciller, mikrokocker och difteroider) vÀxer ofta ut som mikrokolonier pÄ plattan, vilket indikerar förorening.

VÀxtkarakteristika: E. coli och andra gramnegativa bakterier vÀxer inom ett dygn med relativt stora (diameter >2mm), opaka, blanka, slÀta kolonier. Laktospositiva bakterier blir gulfÀrgade, ofta med gult fÀrgomslag i substratet. Grampositiva bakterier som stafylokocker och enterokocker vÀxer med mindre, ofta gula kolonier (diameter 1-2mm). Growth index för de flesta bakterietyper nÀra de för blodagar.


  • Recept: CLED-agar (enligt Mackey och Sandys, OXOID CM301)
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Pepton---- 4,0
    • ”Lab-Lemco” pulver---- 3,0
    • Trypton---- 4,0
    • Laktos---- 10,0
    • L-cystein---- 0,128
    • BromtymolblĂ„tt---- 0,02
    • Agar---- 15,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C

5. Kromagar för urindiagnostik (ej referenssubstrat)

Indikation: Medier lÀmpade för rutindiagnostiska ÀndamÄl, i första hand urindiagnostik, dÀr de kan vara alternativ till referenssubstrat (CLED-agar). AnvÀnds för presumtiv artdiagnostik av vissa kliniskt relevanta bakteriearter, sÀrskilt E. coli, men ocksÄ för att urskilja olika mÄlbakterier i blandfloror.

Princip: Kromagar för urindiagnostik Àr komponerade som differentierande, icke selektiva medier för isolering och identifiering av bakterier frÄn kliniska prov. En sÀrskild kromogen mix (pÄvisar aktivitet av speciesspecifika enzymer) fÄr bakteriekolonierna efter aerob inkubering att framtrÀda med i olika fÀrger. Eftersom fÀrgerna med hög specificitet Àr relaterade till vissa vanliga bakteriearter kan mediet anvÀndas för presumtiv artdiagnostik i rutindiagnostiken enligt laboratoriets rutiner för bakteriediagnostik.

VÀxtkarakteristika: Som exempel anges BD CHROMagar Orientation medium . Enligt tillverkaren skall bakteriekolonier framtrÀda i följande fÀrger

  • E. coli----- rosa till vinrött (via beta-galaktosidasaktivitet)
  • Enterokocker----- bĂ„grön
  • KES (Klebsiella/Serratia/Enterobacter)-----blĂ„ till mörkblĂ„
  • Proteeae----- beige med omgivande brun ring (cirka 50 % av P. vulgaris Ă€r blir blĂ„a med brun ring)
  • S. saprophyticus----- ljusrosa till rosa

Prestanda: Se artikel Kromogena substrat


  • Recept: BD CHROMagar Orientation medium (Becton Dickinson, Levereras som fĂ€rdiga hela plattor i PetriskĂ„lar (9 cm))
    • InnehĂ„ll---- Gram/L
    • Krompepton---- 16,1
    • Kromogen Mix ---- 1,3
    • Agar---- 15,
    • Renat vatten ------ 1 L



Substratkontroll fasta odlingsmedier för urindiagnostik

Urinbilaga1.jpg