Virologisk diagnostik vid NLI-allmänt

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Nedre luftvägsinfektioner, 2:a upplagan 2005

---

Virologisk diagnostik - laboratoriemetodik

Virusodling

Virusodling utförs bara på enstaka viruslaboratorier vid regionsjukhusen, och ytterligare metodbeskrivning ges därför inte i denna utgåva.

Antigenpåvisning

(se också Bilaga 4 Infektionsserologi och antigenpåvisning-NLI)

Antigendetektion med immunfluorescens utförs för att påvisa virala antigen i infekterade celler i nasofarynxaspirat. I tidigt sjukdomsförlopp innehåller nasofarynxaspirat rikligt med virusinfekterade celler. I den infekterade cellen påvisas virala antigen med specifika antisera. Tekniken lämpar sig speciellt vid diagnostik på barn för såväl snabbdiagnostik som epidemiologisk screening. För en korrekt bedömning och tolkning fordras vana vid undersökning av kliniska prov med fluorescensmetodik. Med moderna reagens är diagnostik av t.ex. RS-virus relativt lätt, då förekomsten av infekterade celler vanligen är riklig. Motsvarande diagnostik av adeno- och influensavirus kan däremot vara svår.

-provtagning. Se nasofarynxaspirat. Vissa laboratorier tar även emot utstryk av celler på objektglas efter provtagning med nasofarynxpinne (kompletterande isolering då ej möjlig), alternativt nasofarynxpinne i koksalt eller medium från vilken cellerna skakas loss. Tag kontakt med undersökande laboratorium för exakt anvisning.

-preparation av celldepositioner på objektglas vid laboratoriet. Sekretet i sin slemsamlare, eller överfört till centrifugrör om slemsamlaren har vågrät botten, skakas hastigt upp för hand med 1-2 mL fysiologisk koksalt. Tag ev. av material för virusodling eller PCR redan före centrifugering om det inskickade materialet förefaller vara cellrikt. Känsligheten av dessa tester kan öka om det finns celler med i undersökt material. Röret centrifugeras därefter i bordscentrifug 1000-1500 varv/min under 10 min. Överfasen kan även den användas till virusodling och/eller PCR. Bottensatsen innehåller celler och slem. Cellerna tvättas genom att pelleten späds med ca 1 mL fysiologisk koksalt och därefter bryts upp genom upprepade uppsugningar i pasteurpipett. Under fortsatta uppsugningar och utblåsningar i pasteurpipetten, tillsätts koksalt i 1-2 mL-portioner upp till en mängd av 8-10 mL (röret hålls riktat från undersökaren för att minska smittrisken från aerosol). Röret granskas och större slemklumpar avlägsnas med pasteurpipetten. Cellerna pelleteras genom 10 min centrifugering i bordscentrifug vid 1000-1500 varv/min. Hela överfasen avlägsnas med pasteurpipett. Några droppar fysiologisk koksalt tillsätts, cellerna blandas försiktigt och läggs i droppar på ett objektglas med teflonmask och 6 eller 8 platser för cell-”spots” (områden om högst 1/2 cm diameter kan markeras på glaset). Alternativt görs s.k. cyto-preparat genom centrifugering i cytocentrifug. Glaset lufttorkas och fixeras i vattenfri aceton i rumstemp 5 min. Preparatet kan därefter immunfluorescensfärgas.

-förvaring av preparat. Preparat som ej omedelbart undersöks kan förvaras i kylskåp upp till en vecka. Vid längre tids förvaring fryses preparaten, helst i –70 °C . Då upprepad tining-frysning gör att kondensvatten bildas på objektglaset och förstör virala antigen i cellerna, skall preparaten förvaras i låda eller kartong för endast 5-10 preparat som inte onödigtvis öppnas.

Försiktighet iakttages så att reagens från ett område med celler inte spolas över till ett annat område. Sköljmomenten är viktiga och sköljning bör ske 3 x 10 min med magnetomrörare i kärlets botten, såvida inte annan information ges i missiv till kommersiellt testkit. Fyll alltid kyvetten med väska innan preparatet ställs ner, så att inte koncentrerad antikropp rinner från en brunn till en annan.

-kontrastfärgning. Evans blue eller aminosvart används efter avslutad färgning eller som tillsats till konjugatet.

-tolkning. Bedömning av immunfluorescensfärgade kliniska preparat är understundom svår. Fc-receptorer, autofluorescens, ospecifika reaktioner med vita blodkroppar och andra celler samt närvaro av oönskade antikroppar i använda reagenser försvårar bedömningen. Vissa kommersiella reagens färgar endast specifika virala antigen, andra kan ha växlande kvalitet där ospecifik fluorescens kan vara ett problem. På grund av dessa svårigheter bör mikroskoperingen utföras av erfaren person. Läsning sker mestadels vid 400 x förstoring.

Antigendetektion med ELISA finns för påvisning av virala antigen i nasofarynxsekret. Prov tas som ovan beskrivet för immunfluorescens. ELISA utförs på obehandlat sekret och det är viktigt att onödig utspädning inte görs vid insamling eller fortsatt hantering av provet. För RSV och influensa finns kommersiella tester, som kan användas för patientnära analys. Hittills är dessa produkters prestanda lägre jämfört med IF och framförallt om de hanteras av icke laboratorievan personal. Senare utvärderingar av snabbtester bland annat på SMI (personligt meddelande Mia Brytting) för influensa i samband med pandemin 2009, visar att känsligheten med denna metod är betydligt sämre än med nukleinsyrabaserade metoder, varför snabbtester ej kan rekommenderas för influensadiagnostik.

Nukleinsyrabaserad diagnostik

Påvisande av nukleinsyra från influensavirus är i dag en etablerad metod vid flera av landets mikrobiologiska laboratorier. I samband med den 2009 aktuella pandemin med influensa (H1N1) A, övergick nästan alla laboratorier från snabbtest- och immunfluorescenspåvisning till känsligare PCR-metoder. Övergången kunde verifieras genom EQUALIS-paneler. Se för övrigt artikeln Influensa A, B.

Eftersom påvisande av nukleinsyra från flera andra luftvägsvirus ännu bara används vid ett begränsat antal laboratorier, ges ingen detaljerad beskrivning i denna utgåva.

Elektronmikroskopi

Se under diagnostik av nedre luftvägsinfektioner – allmänt och SARS.

Antikroppsdetektion (serologi)

Se under respektive virus.