Virologisk diagnostik vid NLI-allmÀnt

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Nedre luftvÀgsinfektioner, 2:a upplagan 2005


Virologisk diagnostik - laboratoriemetodik

Virusodling

Virusodling utförs bara pÄ enstaka viruslaboratorier vid regionsjukhusen, och ytterligare metodbeskrivning ges dÀrför inte i denna utgÄva.


AntigenpÄvisning

(se ocksÄ Bilaga 4 Infektionsserologi och antigenpÄvisning-NLI)

Antigendetektion med immunfluorescens utförs för att pÄvisa virala antigen i infekterade celler i nasofarynxaspirat. I tidigt sjukdomsförlopp innehÄller nasofarynxaspirat rikligt med virusinfekterade celler. I den infekterade cellen pÄvisas virala antigen med specifika antisera. Tekniken lÀmpar sig speciellt vid diagnostik pÄ barn för sÄvÀl snabbdiagnostik som epidemiologisk screening. För en korrekt bedömning och tolkning fordras vana vid undersökning av kliniska prov med fluorescensmetodik. Med moderna reagens Àr diagnostik av t.ex. RS-virus relativt lÀtt, dÄ förekomsten av infekterade celler vanligen Àr riklig. Motsvarande diagnostik av adeno- och influensavirus kan dÀremot vara svÄr.

-provtagning. Se nasofarynxaspirat. Vissa laboratorier tar Àven emot utstryk av celler pÄ objektglas efter provtagning med nasofarynxpinne (kompletterande isolering dÄ ej möjlig), alternativt nasofarynxpinne i koksalt eller medium frÄn vilken cellerna skakas loss. Tag kontakt med undersökande laboratorium för exakt anvisning.

-preparation av celldepositioner pĂ„ objektglas vid laboratoriet. Sekretet i sin slemsamlare, eller överfört till centrifugrör om slemsamlaren har vĂ„grĂ€t botten, skakas hastigt upp för hand med 1-2 mL fysiologisk koksalt. Tag ev. av material för virusodling eller PCR redan före centrifugering om det inskickade materialet förefaller vara cellrikt. KĂ€nsligheten av dessa tester kan öka om det finns celler med i undersökt material. Röret centrifugeras dĂ€refter i bordscentrifug 1000-1500 varv/min under 10 min. Överfasen kan Ă€ven den anvĂ€ndas till virusodling och/eller PCR. Bottensatsen innehĂ„ller celler och slem. Cellerna tvĂ€ttas genom att pelleten spĂ€ds med ca 1 mL fysiologisk koksalt och dĂ€refter bryts upp genom upprepade uppsugningar i pasteurpipett. Under fortsatta uppsugningar och utblĂ„sningar i pasteurpipetten, tillsĂ€tts koksalt i 1-2 mL-portioner upp till en mĂ€ngd av 8-10 mL (röret hĂ„lls riktat frĂ„n undersökaren för att minska smittrisken frĂ„n aerosol). Röret granskas och större slemklumpar avlĂ€gsnas med pasteurpipetten. Cellerna pelleteras genom 10 min centrifugering i bordscentrifug vid 1000-1500 varv/min. Hela överfasen avlĂ€gsnas med pasteurpipett. NĂ„gra droppar fysiologisk koksalt tillsĂ€tts, cellerna blandas försiktigt och lĂ€ggs i droppar pĂ„ ett objektglas med teflonmask och 6 eller 8 platser för cell-”spots” (omrĂ„den om högst 1/2 cm diameter kan markeras pĂ„ glaset). Alternativt görs s.k. cyto-preparat genom centrifugering i cytocentrifug. Glaset lufttorkas och fixeras i vattenfri aceton i rumstemp 5 min. Preparatet kan dĂ€refter immunfluorescensfĂ€rgas.

-förvaring av preparat. Preparat som ej omedelbart undersöks kan förvaras i kylskĂ„p upp till en vecka. Vid lĂ€ngre tids förvaring fryses preparaten, helst i –70 °C . DĂ„ upprepad tining-frysning gör att kondensvatten bildas pĂ„ objektglaset och förstör virala antigen i cellerna, skall preparaten förvaras i lĂ„da eller kartong för endast 5-10 preparat som inte onödigtvis öppnas.

Försiktighet iakttages sÄ att reagens frÄn ett omrÄde med celler inte spolas över till ett annat omrÄde. Sköljmomenten Àr viktiga och sköljning bör ske 3 x 10 min med magnetomrörare i kÀrlets botten, sÄvida inte annan information ges i missiv till kommersiellt testkit. Fyll alltid kyvetten med vÀska innan preparatet stÀlls ner, sÄ att inte koncentrerad antikropp rinner frÄn en brunn till en annan.

-kontrastfÀrgning. Evans blue eller aminosvart anvÀnds efter avslutad fÀrgning eller som tillsats till konjugatet.

-tolkning. Bedömning av immunfluorescensfÀrgade kliniska preparat Àr understundom svÄr. Fc-receptorer, autofluorescens, ospecifika reaktioner med vita blodkroppar och andra celler samt nÀrvaro av oönskade antikroppar i anvÀnda reagenser försvÄrar bedömningen. Vissa kommersiella reagens fÀrgar endast specifika virala antigen, andra kan ha vÀxlande kvalitet dÀr ospecifik fluorescens kan vara ett problem. PÄ grund av dessa svÄrigheter bör mikroskoperingen utföras av erfaren person. LÀsning sker mestadels vid 400 x förstoring.

Antigendetektion med ELISA finns för pÄvisning av virala antigen i nasofarynxsekret. Prov tas som ovan beskrivet för immunfluorescens. ELISA utförs pÄ obehandlat sekret och det Àr viktigt att onödig utspÀdning inte görs vid insamling eller fortsatt hantering av provet. För RSV och influensa finns kommersiella tester, som kan anvÀndas för patientnÀra analys. Hittills Àr dessa produkters prestanda lÀgre jÀmfört med IF och framförallt om de hanteras av icke laboratorievan personal. Senare utvÀrderingar av snabbtester bland annat pÄ SMI (personligt meddelande Mia Brytting) för influensa i samband med pandemin 2009, visar att kÀnsligheten med denna metod Àr betydligt sÀmre Àn med nukleinsyrabaserade metoder, varför snabbtester ej kan rekommenderas för influensadiagnostik.

Nukleinsyrabaserad diagnostik

PĂ„visande av nukleinsyra frĂ„n influensavirus Ă€r i dag en etablerad metod vid flera av landets mikrobiologiska laboratorier. I samband med den 2009 aktuella pandemin med influensa (H1N1) A, övergick nĂ€stan alla laboratorier frĂ„n snabbtest- och immunfluorescenspĂ„visning till kĂ€nsligare PCR-metoder. ÖvergĂ„ngen kunde verifieras genom EQUALIS-paneler. Se för övrigt artikeln Influensa A, B.

Eftersom pÄvisande av nukleinsyra frÄn flera andra luftvÀgsvirus Ànnu bara anvÀnds vid ett begrÀnsat antal laboratorier, ges ingen detaljerad beskrivning i denna utgÄva.

Elektronmikroskopi

Se under diagnostik av nedre luftvĂ€gsinfektioner – allmĂ€nt och SARS.


Antikroppsdetektion (serologi)

Se under respektive virus.