Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Artikel uppdaterad april 2012


Huvudartikel: Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002


Laboratoriediagnostik

AllmÀnt

Alla arter av Yersinia (med undantag av Y. pestis) tillhör skyddsklass 2.

Referensmetodik

Referenssubstrat

NedanstÄende substrat utgör referenssubstrat vid primÀrisolering av Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis frÄn humana fecesprov (recepten Äterfinns i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat och i Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener).

  • Yersinia selective agarbas enligt Schiemann (CIN-agar) [Bilaga 1.1.5]: JĂ€mfört med icke inhibitoriskt kontrollsubstrat vĂ€xer de flesta stammarna med GI >50 %. MĂ„nga stammar av Y. pseudotuberculosis vĂ€xer inom tvĂ„ dygn med samma koloniutseende som Y. enterocolitica.

PĂ„ XLD- eller Hektoen-agar kan Yersinia-bakterier ocksĂ„ vĂ€xa, men vĂ€xer dĂ„ med kolonier av samma utseende som övriga koliforma bakterier. PĂ„ DC-agar kan Y. enterocolitica vĂ€xa med typiska smĂ„ ”gnistrande” kolonier.

Generellt rekommenderas nÄgot av de kommersiella halvfabrikat som finns pÄ marknaden. AngÄende testning av tillverkningssatser och fortlöpande kvalitetskontroll, se Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial.

Isolering

  • PrimĂ€r utodling: Provmaterial pĂ„ provtagningspinne stryks ut pĂ„ CIN-agar och sekundĂ€rstryk görs. Plattan inkuberas i 28 °C - 30 °C i ett och tvĂ„ dygn.
  • Anrikning: se under avsnittet avvikelser frĂ„n referensmetodiken.

Identifiering och minimikriterier

  • Presumtiv diagnos: Typiskt koloniutseende för Y. enterocolitica Ă€r smĂ„, centralt mörkröda och i periferin fĂ€rglösa kolonier, som vĂ€xer ut inom ett dygn s.k. "bull’s eye". Efter tvĂ„ dygn kan utseendet vara mer svĂ„rtolkat. Y. pseudotuberculosis har ett likartat utseende pĂ„ CIN-agar, men i de fall bakterierna vĂ€xer ut sker detta ofta först efter tvĂ„ dygns inkubering.
  • Slutlig diagnos: En sĂ€ker identifiering av en patogen Yersinia med potential att orsaka yersinos krĂ€ver förutom en utökad biokemisk testpanel för faststĂ€llande av biotyp (BT 1B, BT 2, BT 3, BT 4 och BT 5) Ă€ven att stammen agglutinerar i antiserum samt att virulensplasmiden och kromosomal virulensgen pĂ„visas. Referensmetod för hur detta skall göras beskrivs nedan.

MisstÀnkta kolonier plockas och karakteriseras med biokemiskt testbatteri samt renstryks pÄ MacConkey-agar som inkuberas i rumstemperatur eller 28 °C - 30 °C, över natt. Resultatet av biokemisk testning avlÀses och tolkas enligt tabell 12.


Tabell 12. Biokemiska referenssubstrat och förvÀntade resultat efter inkubering i 28 °C -30 °C vid identifiering av Yersinia-bakterier (1)

Typiskt för Mannit LD OD H2S ONPG Indol Urea
Y. enterocolitica +/0 gas - +/- - + - +
Y. pseudotuberculosis +/0 gas - - - + - +

(1) Observera att ovanstÄende biokemiska utfall ej sÀkert identifierar humanpatogena Yersinia-stammar. Kompletterande tester mÄste dÀrför utföras (se text).


Vid misstanke pÄ Yersinia enligt utfall enligt tabell 12 kan agglutinationstest i serogrupp-specifikt (O3 och O9) antiserum med bakterier utvÀxta pÄ MacConkey-agarplattor inkuberade vid 28 °C - 30 °C utföras. Observera att inget O-antigen produceras vid 37 °C . Inte heller VP-reaktionen Àr positiv vid 37 °C.

Oavsett resultatet av agglutinationstestet skall ytterligare identifiering ske med kommersiell analysbricka (t.ex. API 20E), vilken inkuberas enligt tillverkarens rekommendationer. Den kommersiella testbrickan skall kompletteras med test för eskulinhydrolys (om sÄdan saknas i brickan) t.ex. med ROSCO-tabletter för att sÀrskilja Y. enterocolitica biotyp 1A, som Àr eskulinpositiv. Notera att Àven Y. pseudotuberculosis Àr positiv i eskulin. Ett likvÀrdigt alternativ till eskulintest Àr pyrazinamidtest som ocksÄ finns tillgÀnglig som ROSCO-tabletter. I tabell 13 sammanfattas olika utfall av referenstesterna och i tabell 14 och tabell 15 anges ytterligare kriterier (ej minimikriterier).


Tabell 13. Utfall av referenstester för diagnostik av humanpatogena Yersinia-bakterier, samt tolkning av resultatet

Biokemiskt testbatteri indikerar Kommersiell analysbricka Eskulin-hydrolys Aggl (O3/O9) Tolkning
Y. enterocolitica + - + Y. enterocolitica O3 resp. O9
Y. enterocolitica + - - annan humanpatogen serogrupp eller ej humanpatogen Yersinia, - Reflab
Y. enterocolitica + + - Y. enterococlitica biotyp 1A
Y. enterocolitica + (-) +/- + oklart, -Reflab
Y. pseudotuberculosis + + - Y. pseudotuberculosis *
Y. pseudotuberculosis + - - oklart, -Reflab



  • Slutlig identifiering: I tabell 14 anges ytterligare diagnostiska kriterier för yersinosframkallande organismer. Oklara fall och fall med ”annan serogrupp” enligt Tabell 13 vilka kan sĂ€ndas till Referenslaboratorium testas dĂ€r med detta batteri. DĂ€r utökas ocksĂ„ agglutinationstestet i serogruppsspecifikt antiserum till att förutom O3 och O9 ocksĂ„ omfatta O5, O8 och O27. Testerna kan givetvis ocksĂ„ utföras pĂ„ de enskilda laboratorierna.


Tabell 14. Identifiering av agens motsvarande smittskyddslagens yersinos

VP, 22 C VP, 37 C Rhamnos Salicin Melibios Sackaros AA* 22 C AA 37 C Pyz** Oxidas
YE O3 + - - - - + - + - -
YE O9 + - - - - + - + - -
YE 5/27 mm + - - - - + - + - -
Y. pseudo - - + +/- + - - + -

-* Autoagglutination, kan ersÀttas av specifik PCR -**Pyrazin amidas-test

Avvikelser frÄn referensmetodiken

Referensmetodiken anger en relativt hög ambitionsnivÄ för diagnostik av patogena Yersinia. I det praktiska arbetet pÄ ett rutinlaboratorium kan diagnosen Y. enterocolitica O3 och O9, av en trÀnad bakteriolog, oftast stÀllas med betydligt fÀrre biokemiska tester och utan att pÄvisa virulensplasmiden. Viktigt Àr dÄ att man har gjort en jÀmförande studie som visar att de förenklingar som gjorts inte negativt pÄverkar specificiteten av diagnostiken. Kommersiell selektiv peptonbuljong (t.ex. Yersinia selective enrichment broth acc. to Ossmer) kan anvÀndas för anrikning, men uppgift saknas över metodens effektivitet. Det Àr ocksÄ acceptabelt att anvÀnda selektivt Yersinia agarsubstrat enligt Wauters [Bil. 1.1.6].

För primÀrisolering av Y. pseudotuberculosis kan MacConkey-agar utgöra ett komplement. Odling vid 22 °C och 28 °C-30 °C kan normalt ersÀttas med odling i rumstemperatur.

Autoagglutination kan ersÀttas med ett test pÄ kongorött-magnesiumoxalat (CR-MOX) agar, som pÄvisar kalciumberoende eller med specifik och utvÀrderad molekylÀrgenetisk metod (t.ex. PCR) för att pÄvisa virulensplasmiden.

Övrig diagnostik

Numera finns alternativ diagnostik som förutom ett alternativt biotypningschema (tabell 15) i viss omfattning baseras pÄ molekylÀrgenetiska metoder för artbestÀmning samt virulens- och subtypning av yersiniaisolat. De molekylÀra metoderna kan i viss utstrÀckning ocksÄ tillÀmpas direkt pÄ humana fecesprov.

MisstÀnkta Y. enterocolitica-isolat pÄ CIN-agar testas för nÀrvaro av virulensplasmiden (pYV) med PCR eller CR-MOX-agar för att faststÀlla potential att orsaka typisk yersinos. Negativa isolat testas enligt tabell 15 för att identifiera isolat av Y. enterocolitica biotyp 1A. Positiva isolat testas enligt samma schema för faststÀllande av de patogena biotyperna, BT 1B, BT 2, BT 3, BT 4 och BT 5. De kan dessutom testas med PCR för pÄvisande av kromosomala virulensgener. Typning med serogruppsspecifikt antiserum för O3, O5, O8, O9 och O27 utförs dÀrefter för pÄvisande av de vanligaste bioserotyperna 1B/O8; 2/O9; 2/O5, 27; 3/O5, 27; 3/O3; 4/O3; 5/O3.

MisstÀnkt fynd av BT 1B kan dessutom konfirmeras genom sekvensering av 16S rRNA-gen eller HPI-PCR.


Tabell15yers.jpg


Diagnosen Yersina-infektion kan efter en infektion med serotyp O3 Àven stÀllas med serologi. KÀnsligast Àr en ELISA baserad pÄ lipopolysackarid vilken anvÀnds vid vissa laboratorier. Serologiska tester som anvÀnder avdödade bakterier som antigen finns ocksÄ.

Epidemiologisk typning

Utöver serotypning har en rad molekylÀra metoder etablerats för epidemiologisk typning t.ex. MLST, PFGE och MLVA.

Kvalitetskontroll

Metodkalibrering förvÀntas ske efter de principer som skisseras under avsnittet kvalitetssÀkring i allmÀn del.

Referenstammar

Tabell 16. Lista över Yersinia-stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer

Bakterie CCUG ATCC Karakteristika VÀxt (1) pÄ CIN
Y. enterocolitica O3 8 233 Normalvariant, indol- >50
Y. enterocolitica O8 33 055 27 729 Normalvariant, indol- >10
Y. enterocolitica O9 82 39A Normalvariant, indol+ >50
Y. pseudotuberculosis 17 342 >25 (2)
  • 1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s. antalet CFU pĂ„ testagar x100/antalet CFU pĂ„ kontrollagar (CLED eller MacConkey), se Bilaga 1.2 subÂŹstrat-prövning.
  • 2) Efter 2 dygns inkubering.

Referensserum

Yersinia O3 och O9 (Reagensia AB)

ResistensbestÀmning och resistensutveckling

Inga studier talar för gynnsam effekt av antibiotikabehandling pÄ duration av tarmsymtom. Utdragna eller komplicerade infektioner kan behandlas med doxycyklin eller fluorokinoloner, dock med osÀker effekt pÄ uppkomsten av reaktiv artrit. Septisk Yersinia-infektion behandlas med fluorokinoloner, trim/sulfa eller senare generationer av cefalosporiner.

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Det skall observeras att isolat av Y. enterocolitica biotyp 1A generellt inte betraktas som humanpatogen, men vissa stammar kan vara sjukdomsframkallande. Denna biotyp har hittills visats sig vara eskulinpositiva och dÀrför har testning för eskulinhydrolys medtagits i referensmetodiken. Fynd av Yersinia enterocolitica (utom biotyp 1A) och Yersinia pseudotuberculosis Àr anmÀlningspliktiga.