Visa källa för Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC

''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002]]''

----
'''EJ REDIGERAD'''

== PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (Folkhälsomyndigheten) ==



=== Analysprincip/teststrategi ===

Prov utodlas på medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. 
De utväxta bakterierna i primärstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

'''Tabell 31.'''

*'''Målgen	Bakterietyp	Amplimer'''	

*''stx1''	EHEC/Shiga-/verotoxigena	130 (bp)	
*''stx2	''EHEC/Shiga-/verotoxigena	298 (bp)	
*''eae	''EHEC/EPEC	376 (bp)	
*''ial	''EIEC/''Shigella	''320 (bp)	
*''bfpA	''EPEC	367 (bp)	
*''eltB	''ETEC	322 (bp)	
*''estA	''ETEC	147 (bp)



=== Reagens ===

'''Kontroller ([[Diarréframkallande Escherichia coli-laboratoriediagnostik|tabell 17]])''' slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.

Negativ kontroll ''E.coli'' ATCC 11775. 

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.

dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.


[[Fil:Fecestabell32.jpg]]

==== Analysprocedur ====

*Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka <math>10^9</math>-5x<math>10^9</math> bakterier/mL).
*Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
*Koka röret i 20 minuter.
*Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100 °C.
*Pelletera cellresterna.

=== PCR ===

*'''Mix / PCR-rör	antal µL''' 
**GeneAmp 		10x PCR buffert II	2,0
**dNTP 			1,25mmol/L	1,6
**MgCl<sub>2</sub>			25mmol/L	1,2
**Primer av varje		2,5µmol/L	0,4
**Taq			5U/µL		0,1
**sterilt H<sub>2</sub>O		upp till 		18,0 µL


Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.



*'''PCR-program'''

**4 min 96°C
**20 sek 94°C
**20 sek 55°C	              30 cykler
**10 sek 72°C

7 min 72°C


=== Post-PCR ===

10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 minuter. Om ''stx''1 eller ''estA'' (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

== REFERENSER ==

*'''Målgen	Åtkomstnummer EMBL DNA-databas'''
*''stx1''	X07865
*''stx2''	X07865
*''eae''	X60439
*''bfpA''	Z12295
*  ''eltB''	Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of ''E.coli'' pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
* ''estA''	Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an ''E.coli'' heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
*  ''ial''	Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of ''Shigella'' in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256


[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]