Bilaga 3 Nukleinsyrapåvisning-NLI - Versionshistorik

Öjar Melefors: /* Nukleinsyrapåvisning av Bordetella pertussis (ej referensmetodik) */

2014-01-14T14:02:35Z

Nukleinsyrapåvisning av Bordetella pertussis (ej referensmetodik)

Magnus Thore den 17 december 2009 kl. 21.12

2009-12-17T21:12:56Z

Magnus Thore den 13 december 2009 kl. 16.24

2009-12-13T16:24:05Z

Visa ändringar

Magnus Thore den 8 december 2009 kl. 22.52

2009-12-08T22:52:57Z

Magnus Thore den 6 december 2009 kl. 21.40

2009-12-06T21:40:10Z

Magnus Thore den 6 december 2009 kl. 21.21

2009-12-06T21:21:04Z

Magnus Thore den 6 december 2009 kl. 20.58

2009-12-06T20:58:08Z

Magnus Thore: Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Nedre luftvägsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005'' ---- '''EJ REDIGERAD''' 3.1. Nukleinsyrapåvisni…'

2009-11-25T20:16:38Z

Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Nedre luftvägsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005'' ---- '''EJ REDIGERAD''' 3.1. Nukleinsyrapåvisni…'

Ny sida

''Till innehållsförteckningen för [[Nedre luftvägsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005]]''

----
'''EJ REDIGERAD'''
3.1. Nukleinsyrapåvisning av Mycoplasma pneumoniae

PCR Analysprincip: Analys sker med PCR–metod genom amplifiering av konserverade nukleinsyra-(DNA)-sekvenser (mål–DNA) inom gen för Mycoplasma pneumoniae P–1 adhesin protein. Vid analysen upphettas provet så att DNA denatureras. Primers specifika för i provet eventuellt befintligt mål–DNA binder till detta. Med hjälp av termostabilt polymeras kopieras därefter mål–DNA - sekvenserna under 40 cykler vilket resulterar i ca 109 kopior av amplimer med 466 baspar. Detektion av slutprodukten sker med elektrofores.

Reagens
Primer 1 och 2 (p-11 och p12):
p-11: 5´-TGC CAT CAA CCC GCG CTT AAC –3´
p-12: 5´-CCT TTG CAA CTG CTC ATA GTA –3
AmpliTaq Polymeras (Applied Biosystems), Biotech 10xPCR – buffert med BSA och30 mM MgCl2. 10x Sucrose/cresol (Biotech), 10x dNTP mix (CHASE, Applied Biosystems).

Amplicor Respiratory Specimen Preparation Kit (”Lysis reagent”, Roche Diagnostics).

Kontroller: Negativ kontroll och
kontaminationskontroll: sd H2O.
Positiv kontroll: Renat DNA från M. pneumoniae (Quiagen).

Analysprocedur
DNA-extraktion: Vortexa rör med kvarvarande pinne minst 1 minut. Pipettera 1 mL till sterilt eppendorfrör. Centrifugera 15 min och pipettera av överfasen.
Tillsätt 50 L ”lysis reagent” och skaka upp pelleten. Inkubera rören 45 minuter vid 60 oC på värmeblock eller vattenbad.
Tillsätt 50 L ”neutralisation reagent” och 100 L sdH2O.
Ta av 5 L och späd i 45 L sdH2O (templat).

Mix/PCR-rör:
sdH2O 3,9 L
10x buffert med BSA, 30 mM MgCl2 1,0 L
10xdNTP mix (CHASE) 1,0 L
primer 1 (10 pmol/L) 0,5 L
primer 2 (10 pmol/L) 0,5 L
Taq-Polymeras 0,1 L

Tillsätt 2 L templat – DNA (patientprov resp. kontroller) till resp. PCR-rör.

PCR-program:
15 sek 94 oC
5 sek 94 oC
5 sek 50 oC 40 cykler
35 sek 72 oC

30 sek 72 oC

Trippelprov körs på alla patientprover.

Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 L dd H2O till 8 L PCR – mix.
Positiv kontroll: 2 L renat DNA från M. pneumoniae till 8 L PCR-mix.

Identifiering
Gelelektrofores: Utförs enligt lokal metod. Band med förväntad storlek motsvarande 466 baspar avläses som positivt PCR – resultat.

Kvalitetskontroll
För att körning skall godkännas skall analyskontrollerna ge förväntat resultat och ge rätt bandstorlek.

Extern kontroll saknas för närvarande.

Stammarna förvaras i –70 °C.

3.2. Nukleinsyrapåvisning av Chlamydophila pneumoniae

PCR-undersökning avseende Chlamydophila pneumoniae och C. psittaci modifierad från Tong och Sillis (1993). Metoden har prövats under lång tid och vid flera laboratorier och har rekommenderats som referensmetod tillsammans med ytterligare ett par metoder ( Dowell et al. 2001).
Metoden bygger på en PCR i två steg med efterföljande gelelektrofores.
Prov extraheras med Magna Pure eller liknande.
10 µL prov sätts till 40 µL PCR-mix bestående av 200 µM av varje nukleotid samt 0,5 µM av varje primer. Taq-polymeras 1,5 enheter /prov (Promega, Madison, WI, USA) i buffert A tillsammans med Mg-klorid 2,0 mM ingår också i mixen.
Efter första PCR-omgången späds provet 1/50 i vatten varefter en ny PCR-omgång med inre primers utföres enl. ovan.
PCR-steg:
- 95 ºC i 3 min
- därefter
- 95 ºC i 1,5 min, 56 ºC i 1,5 min och 72 ºC
- 40 cykler

Primers:
Externa (sense): 5´-TTA CAA GCC TTG CCT GTA GG – 3´
(anti-sense): 5`-GCG ATC CCA AAT GTT TAA GGC – 3`

Interna (sense): 5`- TTA TTA ATT GAT GGT ACA ATA – 3`
(anti-sense): 5´- ATC TAC GGC AGT AGT ATA GTT – 3´

Gelelektrofores utförs i 2 %-ig agarosgel i TBE-buffert med etidiumbromid enl. standardrecept.

REFERENSER
Tong CY, Sillis M. 1993. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR. J Clin Pathol. 46:313-7.

Dowell SF, Peeling RW, Boman J, Carlone GM, Fields BS, Guarner J, Hammerschlag MR, Jackson LA, Kuo CC, Maass M, Messmer TO, Talkington DF, Tondella ML, Zaki SR. 2001. Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis. 33:492-503.

3.3 Nukleinsyrapåvisning av Bordetella pertussis (ej referensmetodik)

Analysprincip
DNA-sekvenser förstärks genom PCR av realtidstyp med probe detektion av R-Q-typ, även kallad TAQMan®probe.
Metoden är modifierad efter Kosters K, 2001. Målgenen utgörs av IS481, ett repeterat DNA-element som förekommer i B. pertussis men där även andra Bordetella spp kan bära samma eller liknande sekvenselement. Metoden har rekommenderats av en europeisk grupp för studier av B. pertussis toxin, recA eller annan alternativ målgen.
Vid positiv B. pertussis-PCR bör även primärt provmaterial utodlas och erhållen stam sändas till SMI, alternativt sänds primärt provmaterial direkt till SMI för odling. SMI som utför epidemiologisk typning ersätter insändande laboratorium för insänt isolat.
Reagens
DNA-extraktion:
Roche respiratory kit (Amplicor)
Oligonukleootider:
Forward (PPert): ATC AAG CAC CGC TTT ACC C
Reverse (APPert): TTG GGA GTT CTG GTA GGT GTG
Probe(SPert) FAM-AAT GGC AAG GCC GAA CGC TTC A.Dabcyl
Utförande
Provberedning:
Pinnprov och nasofarynxutsug, i andra hand andra typer av sekret från luftvägarna. Provtagningspinne placeras i ett sterilt rör med ca 1 mL vatten och vortexas därefter. Suspenderat prov överförs till lagringsrör. Provtagningssetet sparas i kyl till efter PCR-analysen.
DNA-extraktion:
1. 200 L wash buffert tillsätts 200 L prov.
2. Blandas på vortex och centrifugeras 10 min 12500 rpm.
3. Överfasen avlägsnas och 100 L lysis buffert tillsätts.
4. Proverna vortexas snabbt och spinns ner innan de inkuberas 45 min i 60 C.
5. Proverna spinns ner snabbt och 100 L neutralisationsbuffert tillsätts. Proverna vortexas snabbt och spinns ner.
6. Proverna fördelas på två rör och fryses i –70 C. Om analysen utförs samma dag, vilket förordas, förvaras en alikvot i kyl för denna analys.
Realtids-PCR:
12,5 L Hotstar-mix (QIAgen)
600 nM Forward-primer (PPert)
900 nM Reverse-primer (APPert)
300 nM MgCl2 (1,5 mM MgCl2 motsvarar 1xHotstar Taq-mix)
Total volym per reaktion: 25 L (20 L mix och 5 L templat).
Program (Instrument Rotorgene 3000)
15 min 95 C
[15 s 95 C, 1 min 57 C]x45
(avläsning av fluorescensen efter 1 min 57 C).

REFERENSER
Kosters K, Riffelmann M, Wirsing von König C H. 2001. Evaluation of a real-time PCR assay for detection of Bordatella pertussis and B. parapertussis in clinical samples. J Med Microbiol 50: 436-440.

[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Nedre luftvägsinfektioner]]

@@ Rad 111: / Rad 111: @@
 Metoden är modifierad efter Kosters K, 2001. Målgenen utgörs av IS481, ett repeterat DNA-element som förekommer i ''B. pertussis'' men där även andra ''Bordetella'' spp kan bära samma eller liknande sekvenselement. Metoden har rekommenderats av en europeisk grupp för studier av'' B. pertussi''s toxin, recA eller annan alternativ målgen.
-Vid positiv ''B. pertussis''-PCR bör även primärt provmaterial utodlas och erhållen stam sändas till SMI, alternativt sänds primärt provmaterial direkt till SMI för odling. SMI som utför epidemiologisk typning ersätter insändande laboratorium för insänt isolat.
+Vid positiv ''B. pertussis''-PCR bör även primärt provmaterial utodlas och erhållen stam sändas till Folkhälsomyndigheten, alternativt sänds primärt provmaterial direkt till Folkhälsomyndigheten för odling. Folkhälsomyndigheten som utför epidemiologisk typning ersätter insändande laboratorium för insänt isolat.
 '''Reagens'''
@@ Rad 152: / Rad 152: @@
 *Kosters K, Riffelmann M, Wirsing von König C H. 2001. Evaluation of a real-time PCR assay for detection of ''Bordatella pertussis'' and ''B. parapertussis'' in clinical samples. J Med Microbiol 50: 436-440.
-−
-−
 [[Kategori:Laboratoriediagnostik-Nedre luftvägsinfektioner]]

← Äldre version		Versionen från 17 december 2009 kl. 21.12
Rad 9:		Rad 9:


−	'''PCR Analysprincip:''' Analys sker med PCR–metod genom amplifiering av konserverade nukleinsyra-(DNA)-sekvenser (mål–DNA) inom gen för ''Mycoplasma pneumoniae'' P–1 adhesin protein. Vid analysen upphettas provet så att DNA denatureras. Primers specifika för i provet eventuellt befintligt mål–DNA binder till detta. Med hjälp av termostabilt polymeras kopieras därefter mål–DNA - sekvenserna under 40 cykler vilket resulterar i ca ~~109~~ kopior av amplimer med 466 baspar. Detektion av slutprodukten sker med elektrofores.	+	'''PCR Analysprincip:''' Analys sker med PCR–metod genom amplifiering av konserverade nukleinsyra-(DNA)-sekvenser (mål–DNA) inom gen för ''Mycoplasma pneumoniae'' P–1 adhesin protein. Vid analysen upphettas provet så att DNA denatureras. Primers specifika för i provet eventuellt befintligt mål–DNA binder till detta. Med hjälp av termostabilt polymeras kopieras därefter mål–DNA - sekvenserna under 40 cykler vilket resulterar i ca <math>10^9</math> kopior av amplimer med 466 baspar. Detektion av slutprodukten sker med elektrofores.

	'''Reagens'''		'''Reagens'''

@@ Rad 16: / Rad 16: @@
 Kontroller: Negativ kontroll och
-kontaminationskontroll: sd H2O.
+kontaminationskontroll: sd H<sub>2</sub>O.
 Positiv kontroll: Renat DNA från M. pneumoniae (Quiagen).
@@ Rad 22: / Rad 22: @@
 DNA-extraktion: Vortexa rör med kvarvarande pinne minst 1 minut. Pipettera 1 mL till sterilt eppendorfrör. Centrifugera 15 min och pipettera av överfasen.
 Tillsätt 50 μL ”lysis reagent” och skaka upp pelleten. Inkubera rören 45 minuter vid 60 °C på värmeblock eller vattenbad.
-	Tillsätt 50 μL ”neutralisation reagent” och 100 μL sdH2O.
+	Tillsätt 50 μL ”neutralisation reagent” och 100 μL sdH<sub>2</sub>O.
-	Ta av 5 μL och späd i 45 μL sdH2O (templat).
+	Ta av 5 μL och späd i 45 μL sdH<sub>2</sub>O (templat).
 	Mix/PCR-rör:
-	sdH2O					3,9 μL
+	sdH<sub>2</sub>O					3,9 μL
 x buffert med BSA, 30 mM MgCl2	1,0 μL
 xdNTP mix (CHASE)		1,0 μL
@@ Rad 45: / Rad 45: @@
 	Trippelprov körs på alla patientprover.
-Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 μL dd H2O till 8 μL PCR – mix.
+Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 μL dd H<sub>2</sub>O till 8 μL PCR – mix.
 	Positiv kontroll: 2 μL renat DNA från M. pneumoniae till 8 μL PCR-mix.

@@ Rad 121: / Rad 121: @@
 Total volym per reaktion: 25 μL (20 μL mix och 5 μL templat).
 Program (Instrument Rotorgene 3000)
-min 95 C
+min 95 °C
-[15 s 95 C, 1 min 57 C]x45
+[15 s 95 °C, 1 min 57 °C]x45
-(avläsning av fluorescensen efter 1 min 57 C).
+(avläsning av fluorescensen efter 1 min 57 °C).
 REFERENSER

@@ Rad 21: / Rad 21: @@
 Analysprocedur
 DNA-extraktion: Vortexa rör med kvarvarande pinne minst 1 minut. Pipettera 1 mL till sterilt eppendorfrör. Centrifugera 15 min och pipettera av överfasen.
-Tillsätt 50 L ”lysis reagent” och skaka upp pelleten. Inkubera rören 45 minuter vid 60 °C på värmeblock eller vattenbad.
+Tillsätt 50 μL ”lysis reagent” och skaka upp pelleten. Inkubera rören 45 minuter vid 60 °C på värmeblock eller vattenbad.
-	Tillsätt 50 L ”neutralisation reagent” och 100 L sdH2O.
+	Tillsätt 50 μL ”neutralisation reagent” och 100 μL sdH2O.
-	Ta av 5 L och späd i 45 L sdH2O (templat).
+	Ta av 5 μL och späd i 45 μL sdH2O (templat).
 	Mix/PCR-rör:
-	sdH2O					3,9 L
+	sdH2O					3,9 μL
-x buffert med BSA, 30 mM MgCl2	1,0 L
+x buffert med BSA, 30 mM MgCl2	1,0 μL
-xdNTP mix (CHASE)		1,0 L
+xdNTP mix (CHASE)		1,0 μL
-	primer 1 (10 pmol/L)		0,5 L
+	primer 1 (10 pmol/μL)		0,5 μL
-	primer 2 (10 pmol/L)		0,5 L
+	primer 2 (10 pmol/μL)		0,5 μL
-	Taq-Polymeras			0,1 L
+	Taq-Polymeras			0,1 μL
-Tillsätt 2 L templat – DNA (patientprov resp. kontroller) till resp. PCR-rör.
+Tillsätt 2 μL templat – DNA (patientprov resp. kontroller) till resp. PCR-rör.
 	PCR-program:
@@ Rad 45: / Rad 45: @@
 	Trippelprov körs på alla patientprover.
-Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 L dd H2O till 8 L PCR – mix.
+Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 μL dd H2O till 8 μL PCR – mix.
-	Positiv kontroll: 2 L renat DNA från M. pneumoniae till 8 L PCR-mix.
+	Positiv kontroll: 2 μL renat DNA från M. pneumoniae till 8 μL PCR-mix.
 Identifiering
@@ Rad 108: / Rad 108: @@
 Pinnprov och nasofarynxutsug, i andra hand andra typer av sekret från luftvägarna. Provtagningspinne placeras i ett sterilt rör med ca 1 mL vatten och vortexas därefter. Suspenderat prov överförs till lagringsrör. Provtagningssetet sparas i kyl till efter PCR-analysen.
 DNA-extraktion:
-.	200 L wash buffert tillsätts 200 L prov.
+.	200 μL wash buffert tillsätts 200 μL prov.
 .	Blandas på vortex och centrifugeras 10 min 12500 rpm.
-.	Överfasen avlägsnas och 100 L lysis buffert tillsätts.
+.	Överfasen avlägsnas och 100 μL lysis buffert tillsätts.
 .	Proverna vortexas snabbt och spinns ner innan de inkuberas 45 min i 60 °C.
-.	Proverna spinns ner snabbt och 100 L neutralisationsbuffert tillsätts. Proverna vortexas snabbt och spinns ner.
+.	Proverna spinns ner snabbt och 100μL neutralisationsbuffert tillsätts. Proverna vortexas snabbt och spinns ner.
 .	Proverna fördelas på två rör och fryses i –70 °C. Om analysen utförs samma dag, vilket förordas, förvaras en alikvot i kyl för denna analys.
 Realtids-PCR:
-,5 L	Hotstar-mix (QIAgen)
+,5 μL	Hotstar-mix (QIAgen)
 nM	Forward-primer (PPert)
 nM	Reverse-primer (APPert)
 nM	MgCl2 (1,5 mM MgCl2 motsvarar 1xHotstar Taq-mix)
-Total volym per reaktion: 25 L (20 L mix och 5 L templat).
+Total volym per reaktion: 25 μL (20 μL mix och 5 μL templat).
 Program (Instrument Rotorgene 3000)
 min 95 C