Bilaga 4. Virologiska metoder - Versionshistorik

Öjar Melefors: /* Bestämning av rotavirusantigen i feces med ELISA */

2014-01-14T14:03:58Z

Bestämning av rotavirusantigen i feces med ELISA

Magnus Thore: /* Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik */

2010-01-17T09:19:25Z

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

Magnus Thore: /* Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik */

2010-01-17T09:18:11Z

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

Magnus Thore den 7 december 2009 kl. 07.37

2009-12-07T07:37:35Z

Magnus Thore den 7 december 2009 kl. 07.34

2009-12-07T07:34:47Z

Magnus Thore den 7 december 2009 kl. 07.31

2009-12-07T07:31:03Z

Magnus Thore den 7 december 2009 kl. 07.29

2009-12-07T07:29:32Z

Magnus Thore den 6 december 2009 kl. 21.24

2009-12-06T21:24:20Z

Magnus Thore: /* Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik */

2009-12-03T14:11:01Z

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

Magnus Thore: /* Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik */

2009-12-03T14:10:30Z

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

@@ Rad 14: / Rad 14: @@
 '''Tvättbuffert:'''	0.9% NaCl + 0.05% Tween 20
-'''Antikropp för coatning:'''	Marsvin-antihuman rotavirus-serum (SMI)
+'''Antikropp för coatning:'''	Marsvin-antihuman rotavirus-serum (Folkhälsomyndigheten)
 '''Coatningsbuffert:'''	0.05M sodiumcarbonate, pH 9.5-9.7
@@ Rad 22: / Rad 22: @@
 '''Spädningsbuffert:'''	Trypsineringsbuffert med 0.5% BSA
-'''Antikropp för detektion:'''	Kanin-anti-human rotavirus (SMI)
+'''Antikropp för detektion:'''	Kanin-anti-human rotavirus (Folkhälsomyndigheten)
 '''Konjugat:'''	Peroxidasmärkt get-antikanin IgG (Bio-Rad)
@@ Rad 45: / Rad 45: @@
 ----
-−
 '''Bilaga 4.3'''

@@ Rad 51: / Rad 51: @@
 === Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik ===
-Faecesprovet blandas med vätska i transportröret/provtagningsröret (virus tran-sportmedium, PBS eller fysiologiskt koksalt) till en 10-20 % suspension och homogeniseras med vortex, gärna med tillsats av glaskulor. Provet överförs sedan till ett eppendorfrör och centrifugeras i 5 min. Has¬tigheten avgörs av provets sammansättning och man bör erhålla en överfas som går att pipettera. 200 µl av denna övervätska används sedan direkt för extraktion av adenovirus-DNA med hjälp av QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN) enligt medföljande Blood &Body Fluid Spin Protocol.
+Faecesprovet blandas med vätska i transportröret/provtagningsröret (virus transportmedium, PBS eller fysiologiskt koksalt) till en 10-20 % suspension och homogeniseras med vortex, gärna med tillsats av glaskulor. Provet överförs sedan till ett eppendorfrör och centrifugeras i 5 min. Hastigheten avgörs av provets sammansättning och man bör erhålla en överfas som går att pipettera. 200 µl av denna övervätska används sedan direkt för extraktion av adenovirus-DNA med hjälp av QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN) enligt medföljande Blood &Body Fluid Spin Protocol.
-Arbetet bör ske i sterilbänk (skyddsklass 2) och speciella locköppnare kan användas till eppen¬dorfrören under extraktionen för att minimera risk för kontamination. Prov som innhåller de enteriska varianterna av adenovirus samt prov från immunosuppre¬merade patienter kan innehålla mycket stora kvantiteter av virus och kontamina¬tionsrisken kan i dessa fall betecknas som stor.
+Arbetet bör ske i sterilbänk (skyddsklass 2) och speciella locköppnare kan användas till eppendorfrören under extraktionen för att minimera risk för kontamination. Prov som innhåller de enteriska varianterna av adenovirus samt prov från immunosupprimerade patienter kan innehålla mycket stora kvantiteter av virus och kontaminationsrisken kan i dessa fall betecknas som stor.
 PCR-reaktionen sker i en totalvolym på 50 µl innehållande 10 µl QIAgen-extra-herat prov i 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,0 (20 °C), 200 µM av varje dNTP, 0,5 µM av vardera yttre primer eller 0,5 µM av vardera inre primer samt 1 U Taq DNA polymerase.

@@ Rad 59: / Rad 59: @@
 *PCR-program första amplifieringssteget:
 **1.	95 °C 3 min	1 cykel
-**2.	94 °C 30 s	55 °C 30 s	72 °C 1min	30cykler
+**2.	[94 °C 30 s	55 °C 30 s	72 °C 1min]	30cykler
 **3.	72 °C 3 min	1 cykel
-µl av amplifieringsprodukt från det första PCR-steget överförs till en ny identisk PCR-mix på 45 µl för nested PCR, dock nu med inre primers. Denna mix blandas på speciellt avgränsad yta endast avsedd för hantering av redan ampli-fierat material. OBS! PCR-röret från det första amplifieringssteget skall centri¬fu-geras för att avlägsna kondens innan det öppnas för överföring av amplifikat. Detta är mycket viktigt för att undvika eventuell kontaminering.
+µl av amplifieringsprodukt från det första PCR-steget överförs till en ny identisk PCR-mix på 45 µl för nested PCR, dock nu med inre primers. Denna mix blandas på speciellt avgränsad yta endast avsedd för hantering av redan amplifierat material. '''OBS!''' PCR-röret från det första amplifieringssteget skall centrifugeras för att avlägsna kondens innan det öppnas för överföring av amplifikat. Detta är mycket viktigt för att undvika eventuell kontaminering.
 *PCR-program andra amplifieringssteget; nested PCR:
 *1. 94 °C 1 min	1 cykel
-*2. 94 °C 30 s	55 °C 30 s	72 °C 1min	30 cykler
+*2. [94 °C 30 s	55 °C 30 s	72 °C 1min]	30 cykler
 *3. 72 °C 3 min	1 cykel
-Efter avslutad amplifiering analyseras 15 µl amplifieringsprodukt från både första och andra (nested) amplifieringsstegen tillsammans med 0,5 µg av en definierad molekylviktsstandard på en 2,0-2,5 % agarosegel av kvalitet med hög upplösning för gel-elektrofores. Varje prov och standarden blandas med 2,0 µl loadingbuffert innan separation på gel.Vid en spänning på 100V  30V beräknas en migrationstid på 3  1,5 tim för tillfredställande utvärdering av slutprodukt. Efter slutförd elektrofores infärgas agarosgelen med etidiumbromid (2 µg/ml) i 15 min  10 min. (PCR-produkter = 301bp respektive 171bp för enkel och nested PCR).
+Efter avslutad amplifiering analyseras 15 µl amplifieringsprodukt från både första och andra (nested) amplifieringsstegen tillsammans med 0,5 µg av en definierad molekylviktsstandard på en 2,0-2,5 % agarosegel av kvalitet med hög upplösning för gel-elektrofores. Varje prov och standarden blandas med 2,0 µl loadingbuffert innan separation på gel. Vid en spänning på 100V +- 30V beräknas en migrationstid på 3 +- 1,5 tim för tillfredställande utvärdering av slutprodukt. Efter slutförd elektrofores infärgas agarosgelen med etidiumbromid (2 µg/ml) i 15 min +- 10 min. (PCR-produkter = 301bp respektive 171bp för enkel och nested PCR).
 *Primersekvenser:
@@ Rad 80: / Rad 80: @@
 *nestHex3deg   	5´-GCC CG(CT) GC(AC) ACI GAI AC(GC) TAC TTC-3´
 *nestHex4deg   	5´-CC(CT) AC(AG) GCC AGI GT(AG) (AT)AI CG(AC) (AG)C(CT) TTG TA-3´
 == Referens ==

← Äldre version		Versionen från 7 december 2009 kl. 07.37
Rad 82:		Rad 82:


−	*~~Ref.~~ Allard, A., B. Albinsson, and G. Wadell (2001). Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis. J Clin Microbiol. 39:498-505	+
		+	== Referens ==
		+
		+	*Allard, A., B. Albinsson, and G. Wadell (2001). Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis. J Clin Microbiol. 39:498-505


	[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]		[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]

@@ Rad 31: / Rad 31: @@
 *Metod:
-**1.	Coata med 100 μL/brunn av marsvin-antihuman rotavirus-serum spätt 1/500 i coatningsbuffert. Inkubera över natt vid +4oC eller 3 timmar vid +37oC.
+**1.	Coata med 100 μL/brunn av marsvin-antihuman rotavirus-serum spätt 1/500 i coatningsbuffert. Inkubera över natt vid +4 °C eller 3 timmar vid +37 °C.
 **2.	Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
-**3.	Späd feces 1/10 i PBS – 0.05% BSA. Tillsätt i duplikat 100 μL/brunn. Inkubera 120 min vid 37oC.
+**3.	Späd feces 1/10 i PBS – 0.05% BSA. Tillsätt i duplikat 100 μL/brunn. Inkubera 120 min vid 37 °C.
 **4.	Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
-**5.	Tillsätt 100 μL/brunn av kanin-anti-human rotavirus spätt 1/1000 i spädningsbuffert. Inkubera i 90 min vid 37oC.
+**5.	Tillsätt 100 μL/brunn av kanin-anti-human rotavirus spätt 1/1000 i spädningsbuffert. Inkubera i 90 min vid 37 °C.
 **6.	Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
-**7.	Tillsätt 100 μL/brunn av peroxidasmärkt get-anti-kanin IgG spätt 1/50 000 i spädningsbuffert. Inkubera i 60 min vid +37oC.
+**7.	Tillsätt 100 μL/brunn av peroxidasmärkt get-anti-kanin IgG spätt 1/50 000 i spädningsbuffert. Inkubera i 60 min vid +37 °C.
 **8.	Tvätta 6 gånger med tvättbuffert.
 **9.	Blanda substratlösningen strax innan användning: 100 μL TMB stocklösning i 10 mL substratbuffert. Tillsätt 100 μL/brunn även dör blankavläsning skall göras. Inkubera plattan i 5-10 min vid rumstemperatur.

@@ Rad 40: / Rad 40: @@
 **8.	Tvätta 6 gånger med tvättbuffert.
 **9.	Blanda substratlösningen strax innan användning: 100 μL TMB stocklösning i 10 mL substratbuffert. Tillsätt 100 μL/brunn även dör blankavläsning skall göras. Inkubera plattan i 5-10 min vid rumstemperatur.
-**10.	Reaktionen stoppas genom tillsats av 100 μL 2M H2SO4/brunn även där blankavläsning skall göras.
+**10.	Reaktionen stoppas genom tillsats av 100 μL 2M H<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB>/brunn även där blankavläsning skall göras.
 **11.	Avläs vid 450 nm i en ELISA-spektrofotometer.

@@ Rad 26: / Rad 26: @@
 '''Konjugat:'''	Peroxidasmärkt get-antikanin IgG (Bio-Rad)
-'''Substratbuffert:'''	0,1M Na-citrat-Hac-buffert pH 6.0 innehållande 0,002% H2O2
+'''Substratbuffert:'''	0,1M Na-citrat-Hac-buffert pH 6.0 innehållande 0,002% H<SUB>2</SUB>O<SUB>2</SUB>
 '''Substrat:'''	Tetrametyhylbenzidin, TMB (ICN). TMB.stock; lösning 1% 3.3´,5.5´ tetramethylbenzidin upplöst i DMSO.

← Äldre version		Versionen från 3 december 2009 kl. 14.11
Rad 79:		Rad 79:

	*nestHex3deg 5´-GCC CG(CT) GC(AC) ACI GAI AC(GC) TAC TTC-3´		*nestHex3deg 5´-GCC CG(CT) GC(AC) ACI GAI AC(GC) TAC TTC-3´
−	*nestHex4deg 5´-CC(CT) AC(AG) GCC AGI GT(AG) (AT)AI CG(AC) (AG)C(CT)	+	*nestHex4deg 5´-CC(CT) AC(AG) GCC AGI GT(AG) (AT)AI CG(AC) (AG)C(CT) TTG TA-3´
−	TTG TA-3´

← Äldre version		Versionen från 3 december 2009 kl. 14.10
Rad 86:		Rad 86:


−	[[Kategori:~~Laboratoriemetoder~~-mage och tarm]]	+	[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]