Bilaga 8 (CNS) - Versionshistorik

Magnus Thore den 19 december 2009 kl. 12.28

2009-12-19T12:28:59Z

Magnus Thore den 6 december 2009 kl. 21.06

2009-12-06T21:06:58Z

Magnus Thore den 1 november 2009 kl. 08.25

2009-11-01T08:25:44Z

Magnus Thore: Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet'' ---- == Bilaga 8 == === Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k en…'

2009-11-01T08:17:33Z

Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet'' ---- == Bilaga 8 == === Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k en…'

Ny sida

''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet]]''

----

== Bilaga 8 ==

=== Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k enligt metod från Sahlgrenska sjukhuset, Göteborg, modifierad vid Smittskyddsinstitutet ===

'''Provtagningsmaterial'''

Cerebrospinalvätska (Csv)

Förvaras vid 4 °C eller -20 °C fram till transporten

Transport vid rumstemperatur

'''Apparatur'''

PCR-apparat (TC- 1, Perkin Elmer)

Varjabla pipetter, fördelade på arbetsstationer

Elektroforesutrustning

Polaroidkamera

UV-ljusbord

'''Förbrukningsmaterial'''

0,5 mL PCR-rör

1,5 mL Eppendorfrör

0,5-10 μL tippar utan filter

0,5-10 μL tippar med filter

10-200 μL tippar utan filter

100-1000 μL tippar utan filter

'''Reagens'''

'''H20:''' Sterilt vatten (dest.vatten) av hög renhetsgrad

'''Olja:''' Mineralolja, light

'''Primers:''' Pharmacia Biotech

Förvaras i -20 °C i Rena rummet

Koncentrationer:

1,4 μmol/L: CMVI och CMV2

2,8 μmol/L: CMV3 och CMV4

Samtliga primers är lokaliserade inom fjärde exonet av Major Immediate early gene (UL 122-123)

''1:a amplifieringen''

*CMV1 5’-GCG CCG CAT TGA GGA GAT CTG CAT-3’
*CMV2 5’-GAG CAC CCT CCT CCT crr CCT CAT-3’

Storlek på PCR-fragment: 299 baspar

''2:a amplifieringen''
*CMV3 5’-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3
*CMV4 5-CAG CCA CAA TI’A CTG AGG ACA GAG-3

Storlek på PCR-fragment: 191 baspar

'''10 x PCR buffert II''', Perkin Elmer

Förvaras vid 4 °C.

'''MgCl2,''' Perkin Elmer

Koncentration: 15 mmol/L,

Förvaras vid 4 °C.

'''dNTP,''' Pharmacia Biotech

Koncentration: 2 mmol/L används i en blandning av samtliga nukleotider.

Förvaras vid -20 °C.

'''Enzym,''' Perkin Elmer

Taq polymeras 5 U/uL

Förvaras vid -20 °C.

'''Agaros NA,''' Pharmacia Biotech

Förvaras som pulver i rumstemperatur.

'''10x TBE-buffert,''' Karolinska sjukhuset (KS)

pH 8,0-8,4. Späds i HO till lx TBE-buffert.

Förvaras i rumstemperatur.

'''Etidiumbromid''' (EtBr) KS

Koncentration: 10 mg/mL.

Förvaras i rumstemperatur.

'''6x Loading buffert,''' Scandinavian Diagnostic Services (SDS)

Blue orange loading buffert.

Förvaras vid 4 °C.

*[[Fil:CNStabellbil8.jpg]]

'''Provberedning inför 1:a amplifieringen'''

* Frys likvor vid <-18 °C.
* Tina i rumstemperatur.
* Sätt 10 μL likvor till 0,5 mL PCR-rör i duplikat.
* Tillsätt 1 droppe (-.25 μL) mineralolja. Stäng locket ordentligt.
* Hetta upp likvorprovt i PCR-rören med olja i PCR-maskinen 95 °Ci—10 min.
* De olika momenten i proceduren utförs på fyra separata arbetsstationer för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.
*Skriv analysprotokoll där 1:a röret är en vattenkontroll och patientprov analyseras i duplikat. Vattenkontroller sätts mellan olika patientduplikat. Positiva kontroller sättes sist.
*Förbehandla likvor enil. provbehandling ovan (sättningsbox).
*Plocka fram reagenserna (ren plats) och blanda mastermix 1 i Eppendorfrör 1,5 mL.
*Sätt upp PCR-rör i still (sättningsbox) inklusive de förbehandlade , provrören enligt analysprotokoll.
*Stäng rören och märk locken med nummer enligt analysprotokoll Oppna ett rör i taget i nummerordning.
* Tillsätt 10 μL H20 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpå
* Tillsätt 40 μL mastermix/rör under oljan.
* Stäng rören ordentligt.
* Sätt de positiva kontrollerna sist. Eventuella uppspädning& av positiva kontroller görs efter det att proven är satta och locken ordentligt tillsiutna.

'''1:a amp1ifieringen'''

Kör följande program:

5 min 92 °C

(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C I min)x20 cykler

1 min72°C

sök 4 °C

'''
Provberedning inför 2:a amplifieringen'''

* Gör MastermiX 2 med inre primers (ren plats).
* Sätt upp PCR-rör i ställ.
* Fördela 47,5 μL mastermix/rör
* Tillsätt 1 droppe olja ovanpå.
* Stäng locken och märk locken med nummer enl. analysprotokoll.
* Tag med rören till nestningsplats.
* För över 2,5 μL prov från 1:a steget till de nya rören.

'''Stor risk för kontamination''', öppna därför ett rör i taget.

'''2:a amplifieringen'''

Kör följande program:

5 min 92 °C

(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C 30Sek)X30 cykler

1 min 72 °C

Sök 4 °C

'''Elfores'''

* Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 μg EtBr/mlL agaros i lx TBEbuffert. Gjut en gelform med kammar. Lägg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 μg EtBr/mL TBEbuffert.
* På en remsa parafihIl droppas 2 μL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 μL PCRprodukt. Sätt 10 μL produkt/hål i gelen.
* Starta aggregatet (140 V).
* Låt gelen gå i ca 20-30 min.
* Stäng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den på UV-bordet Ta ett kort till analysprotokoflet

'''Bedömning'''
* Analysen godkänns om 5 och/eller 10 fg av renat CMV DNA kan detekteras.
* Kontrollera storleken av amplifikat jämfört med den positiva kontrollen.
* Om bägge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsajcad CNS-jnfektjon
* Om endast ena portionen blir positiv sätts provet om. Om fyndet kan repeteras svaras provet ut positivt, annars negativt.
* Om oklarheter: Sätt om provet, ev i spädning eller efter DNA-extration om det ger smear.

[[Kategori: CNS-infektioner]]

← Äldre version		Versionen från 1 november 2009 kl. 08.25
Rad 135:		Rad 135:


−	*[[Fil:~~CNStabellbil8~~.jpg]]	+	*[[Fil:CNStabellbil8b.jpg]]

@@ Rad 21: / Rad 21: @@
 PCR-apparat (TC- 1, Perkin Elmer)
-Varjabla pipetter, fördelade på arbetsstationer
+Variabla pipetter, fördelade på arbetsstationer
 Elektroforesutrustning
@@ Rad 77: / Rad 77: @@
 ''2:a amplifieringen''
-*CMV3 5’-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3
+*CMV3 5’-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3’
-*CMV4 5-CAG CCA CAA TI’A CTG AGG ACA GAG-3
+*CMV4 5’-CAG CCA CAA TI’A CTG AGG ACA GAG-3’
 Storlek på PCR-fragment: 191 baspar
@@ Rad 88: / Rad 88: @@
-'''MgCl2,''' Perkin Elmer
+'''MgCl<sub>2</sub>,''' Perkin Elmer
 Koncentration: 15 mmol/L,
@@ Rad 116: / Rad 116: @@
 '''10x TBE-buffert,''' Karolinska sjukhuset (KS)
-pH 8,0-8,4. Späds i HO till lx TBE-buffert.
+pH 8,0-8,4. Späds i H<sub>2</sub>O till lx TBE-buffert.
 Förvaras i rumstemperatur.
@@ Rad 140: / Rad 140: @@
 '''Provberedning inför 1:a amplifieringen'''
-* Frys likvor vid <-18 °C.
+* Frys likvor vid <=-18 °C.
 * Tina i rumstemperatur.
 * Sätt 10 μL likvor till 0,5 mL PCR-rör i duplikat.
-* Tillsätt 1 droppe (-.25 μL) mineralolja. Stäng locket ordentligt.
+* Tillsätt 1 droppe (cirka 25 μL) mineralolja. Stäng locket ordentligt.
 * Hetta upp likvorprovt i PCR-rören med olja i PCR-maskinen 95 °Ci—10 min.
 * De olika momenten i proceduren utförs på fyra separata arbetsstationer för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.
@@ Rad 151: / Rad 151: @@
 *Sätt upp PCR-rör i still (sättningsbox) inklusive de förbehandlade , provrören enligt analysprotokoll.
 *Stäng rören och märk locken med nummer enligt analysprotokoll Oppna ett rör i taget i nummerordning.
-* Tillsätt 10 μL H20 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpå
+* Tillsätt 10 μL H<sub>2</sub>0 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpå
 * Tillsätt 40 μL mastermix/rör under oljan.
 * Stäng rören ordentligt.
@@ Rad 170: / Rad 170: @@
-* Gör MastermiX 2 med inre primers (ren plats).
+'''Provberedning inför 2:a amplifieringen'''
 * Sätt upp PCR-rör i ställ.
 * Fördela 47,5 μL mastermix/rör
@@ Rad 199: / Rad 199: @@
 '''Elfores'''
-* Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 μg EtBr/mlL agaros i lx TBEbuffert. Gjut en gelform med kammar. Lägg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 μg EtBr/mL TBEbuffert.
+* Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 μg EtBr/mlL agaros i lx TBE-buffert. Gjut en gelform med kammar. Lägg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 μg EtBr/mL TBEbuffert.
-* På en remsa parafihIl droppas 2 μL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 μL PCRprodukt. Sätt 10 μL produkt/hål i gelen.
+* På en remsa parafilm droppas 2 μL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 μL PCRprodukt. Sätt 10 μL produkt/hål i gelen.
 * Starta aggregatet (140 V).
 * Låt gelen gå i ca 20-30 min.
-* Stäng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den på UV-bordet Ta ett kort till analysprotokoflet
+* Stäng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den på UV-bordet.
@@ Rad 209: / Rad 210: @@
 * Analysen godkänns om 5 och/eller 10 fg av renat CMV DNA kan detekteras.
 * Kontrollera storleken av amplifikat jämfört med den positiva kontrollen.
-* Om bägge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsajcad CNS-jnfektjon
+* Om bägge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsakad CNS-infektion
 * Om endast ena portionen blir positiv sätts provet om. Om fyndet kan repeteras svaras provet ut positivt, annars negativt.
 * Om oklarheter: Sätt om provet, ev i spädning eller efter DNA-extration om det ger smear.

@@ Rad 104: / Rad 104: @@
 '''Enzym,''' Perkin Elmer
-Taq polymeras 5 U/uL
+Taq polymeras 5 U/μL
 Förvaras vid -20 °C.