Genotypisk MRSA-verifiering - Versionshistorik

Magnus Thore: /* Material */

2013-01-24T12:38:29Z

Material

Magnus Thore: /* Tolkning av resultatet */

2013-01-15T10:02:47Z

Tolkning av resultatet

Magnus Thore: /* Material */

2013-01-15T10:00:23Z

Material

Magnus Thore den 26 juni 2012 kl. 14.09

2012-06-26T14:09:40Z

Magnus Thore: /* PCR */

2012-04-22T14:00:21Z

PCR

Magnus Thore den 22 april 2012 kl. 13.54

2012-04-22T13:54:12Z

Magnus Thore den 22 april 2012 kl. 13.38

2012-04-22T13:38:04Z

Magnus Thore: Skapade sidan med ''''Artikel publicerad april 2012. Innehåll preliminärt i väntan på konsensusförfarande''' ---- ''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukd...'

2012-04-22T13:33:51Z

Skapade sidan med ''''Artikel publicerad april 2012. Innehåll preliminärt i väntan på konsensusförfarande''' ---- ''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukd...'

Ny sida

'''Artikel publicerad april 2012. Innehåll preliminärt i väntan på konsensusförfarande'''
----
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar]]''

och

''förgreningssidan [[MRSA]]''
----
Genotypisk MRSA-verifiering med LightCycler

Indikation
Verifiering av meticillinresistens hos S aureus genom att påvisa mecA-gen och nuc-gen.

MecA-genen kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sänkt affinitet för b-laktamantibiotika,.vilket gör olika arter av mecA-bärande stafylokocker resistenta mot alla b-laktam-antibiotika inkluderande batalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. Särskilt allvarligt är meticillinresistens hos S. aureus, eftersom antibiotika ur denna grupp sedan länge utgjort standardterapi vid infektioner med sådana bakterier. MecA-genen sitter på en mobil kasettkromosom och är därmed benägen att sprida sig.

Metoden är utformad för att påvisa förekomst av mecA-gen hos stafylokocker genom PCR-amplifiering av målområdet och detektion med SYBR Green med realtids-PCR-instrument. I kombination med påvisande av nuc-gen utförd med samma DNA-preparation är den avsedd för verifiering av fynd av MRSA. Primrar för mecA-amplifiering påvisar också en variant av mecA-genen som påvisats i bl.a. stammen LGA251 (1, 2)

Material
Utgångsmaterialet är renstrukna kolonier på blodagar av misstänkta bakterier. För amplifiering används PCR-instrument LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) och reagenser LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics).

Referensstammar: CCUG 35603 S. aureus som kontroll mecA+
CCUG 17621 S. aureus som kontroll mecA-
LGA251 S. aureus som kontroll mecAM10/0061

PCR primer MEC9 5´- TCACCAGGTTCAAC[Y]CAAAA (1)
PCR primer MEC10 5´- CCTGAATC[W]GCTAATAATATTTC (1)
PCR primer NUC4 5’-TCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC (3)
PCR primer NUC5 5’-GAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCT TC (3)

Analys

DNA-frisättning

Slamma en liten koloni eller motsvarande mängd bakterier i 100 µl sterilt avjoniserat vatten i ett sterilt 1.5 mL eppendorfrör. Se till att bakterien blir ordentligt uppslammad i vattnet genom att snurra platinösen och därefter resuspendera suspensionen. Mängden bakterier är lagom för analys när man kan ana en lätt grumlighet

PCR

Varje isolat analyseras i två separata 20 µL PCR-reaktioner, en för detektion av nuc och en för mecA. PCR-reaktionerna innehåller PCR-reagens enligt tillverkarens rekommendation, 0.5 µM av respektive primrar (NUC4/NUC5 respektive MEC9/MEC10) och 2 µL templat (suspension av bakterie).

Följande amplifieringsprofil används:

Program Temp.ºC Tid mm:ss Hastighet ºC/s Acquisition Mode Fast start 95 10:00 20 PCR 3-step 95 00:10 20 none 35 cycler 50 00:05 20 none 72 00:12 20 singel Smältkurva 95 00:10 20 none 50 00:30 20 none 90 00:00 0,1 continuous Cooling 40 00:30 20 none

Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från NUC respektive mecA amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat. Förväntade Tm för mecA PCR-produkt är runt 78.6°C, för mecA LGA251 runt 80.0°C och för NUC runt 79.2°C.

Referenser

1. Laura García-Álvarez et al. Meticillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark: a descriptive study. Lancet Infect Dis 2011;11: 595–603

2 Shore AC et al. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Aug;55(8):3765-73. Epub 2011 Jun 2

3 Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad. Egen design.
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]

@@ Rad 23: / Rad 23: @@
 ** CCUG 35603 ''Staphylococcus aureus''  ''mecA''+
 ** CCUG 17621 ''Staphylococcus aureus''  ''mecA''-
-** NCTC 13552 ''Staphylococcus aureus'' med ''mecA''<sub>LGA251</sub>
+** CCUG 63582 ''Staphylococcus aureus'' med ''mecA''<sub>LGA251</sub>
 *Primrar

@@ Rad 49: / Rad 49: @@
 ====Tolkning av resultatet====
-Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från ''nuc'' respektive   ''mecA'' amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat.  Förväntade Tm för ''mecA'' PCR-produkt är runt 78,6°C, för ''mecA'' LGA251 runt 80.0°C och för ''nuc'' runt 79,2°C.
+Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från ''nuc'' respektive   ''mecA'' amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat.  Förväntade Tm för ''mecA'' PCR-produkt är runt 78,6°C, för ''mecA''<sub>LGA251</sub> runt 80.0°C och för ''nuc'' runt 79,2°C.
-−
 ==REFERENSER==

@@ Rad 21: / Rad 21: @@
 *Referensstammar:
-** CCUG 35603 ''Staphylococcus aureus''  mecA+
+** CCUG 35603 ''Staphylococcus aureus''  ''mecA''+
-** CCUG 17621 ''Staphylococcus aureus''  mecA-
+** CCUG 17621 ''Staphylococcus aureus''  ''mecA''-
-** NCTC 13552 ''Staphylococcus aureus'' med ''mecA''-LGA251
+** NCTC 13552 ''Staphylococcus aureus'' med ''mecA''<sub>LGA251</sub>
 *Primrar
@@ Rad 29: / Rad 29: @@
 **   PCR primer MEC10  5´- CCTGAATC[W]GCTAATAATATTTC (1)
 **     PCR primer NUC4  5’-TCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC (3)
 **     PCR primer NUC5  5’-GAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCT TC (3)
-−
 ===Analys===

@@ Rad 10: / Rad 10: @@
 ===Indikation===
-Verifiering av meticillinresistens hos ''S. aureus'' genom att påvisa ''mecA''-gen och ''nuc''-gen. Metoden är avsedd att användas för verifiering av misstänkta kolonier av MRSA på agarplatta som identifierats i rutin-eller screeningprover. För presumptivt påvisande av MRSA i screeningprover hänvisas till artikel [[MRSA-screening enligt Halmstadmodellen]].
+Verifiering av MRSA genom att påvisa ''mecA''- och ''nuc''-gen. Metoden är avsedd att användas för verifiering av misstänkta kolonier av MRSA på agarplatta som identifierats i rutin-eller screeningprover. För presumptivt påvisande av MRSA i screeningprover hänvisas till artikel [[MRSA-screening enligt Halmstadmodellen]].
-''MecA''-genen kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sänkt affinitet för betalaktamantibiotika,vilket gör olika arter av ''mecA''-bärande stafylokocker resistenta mot alla betalaktam-antibiotika inkluderande betalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. Särskilt allvarligt är meticillinresistens hos ''S. aureus'', eftersom antibiotika ur denna grupp sedan länge utgjort standardterapi vid infektioner med sådana bakterier. ''MecA''-genen sitter på en mobil kasettkromosom och är därmed benägen att sprida sig.
+Genen ''mecA'' kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sänkt affinitet för betalaktamantibiotika,vilket gör olika arter av ''mecA''-bärande stafylokocker resistenta mot alla betalaktam-antibiotika inkluderande betalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. Särskilt allvarligt är meticillinresistens hos ''S. aureus'', eftersom antibiotika ur denna grupp sedan länge utgjort standardterapi vid infektioner med sådana bakterier.
-Metoden som beskrivs här är utformad för att påvisa förekomst av mecA-gen hos stafylokocker genom PCR-amplifiering av målområdet och detektion med SYBR Green med realtids-PCR-instrument. I kombination med påvisande av ''nuc''-gen utförd med samma DNA-preparation är den avsedd för verifiering av fynd av MRSA. Primrar för ''mecA''-amplifiering påvisar också en variant av ''mecA''-genen (''mecAM10/0061'') som påvisats bland annat i stammen LGA251 (1, 2)
+Metoden som beskrivs här är utformad för att påvisa förekomst av ''mecA''-gen hos stafylokocker genom PCR-amplifiering av målområdet och detektion med SYBR Green med realtids-PCR-instrument. I kombination med påvisande av ''nuc''-gen utförd med samma DNA-preparation är den avsedd för verifiering av fynd av MRSA. Primrar för ''mecA''-amplifiering påvisar också en variant av ''mecA''-genen som påvisats bland annat i ''S. aureus''-stammen LGA251 (1, 2)
 === Material===
-Utgångsmaterialet är renstrukna kolonier på blodagar av misstänkta bakterier. För amplifiering används PCR-instrument LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) och reagenser LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics).
+Utgångsmaterialet är renkultur på blodagar av misstänkta bakterier. För amplifiering används PCR-instrument LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) och reagenser LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics).
 *Referensstammar:
 ** CCUG 35603 ''Staphylococcus aureus''  mecA+
 ** CCUG 17621 ''Staphylococcus aureus''  mecA-
-** LGA251 ''Staphylococcus aureus'' mecAM10/0061
+** NCTC 13552 ''Staphylococcus aureus'' med ''mecA''-LGA251
 *Primrar
@@ Rad 31: / Rad 31: @@
 **     PCR primer NUC5  5’-GAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCT TC (3)
-−
 ===Analys===
@@ Rad 38: / Rad 37: @@
 ====DNA-frisättning====
-Slamma en liten koloni eller motsvarande mängd bakterier i 100 µL sterilt avjoniserat vatten i ett sterilt 1.5 mL eppendorfrör. Se till att bakterien blir ordentligt uppslammad i vattnet genom att snurra platinösen och därefter resuspendera suspensionen.
+Slamma en liten koloni eller motsvarande mängd bakterier i 100 µL sterilt avjoniserat vatten i ett sterilt 1.5 mL eppendorfrör. Se till att bakterierna blir ordentligt uppslammade.
 Mängden bakterier är lagom för analys när man kan ana en lätt grumlighet.
@@ Rad 52: / Rad 51: @@
 ====Tolkning av resultatet====
-Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från NUC respektive   mecA amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat.  Förväntade Tm för mecA PCR-produkt är runt 78.6°C, för mecA     LGA251 runt 80.0°C och för NUC runt 79.2°C.
+Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från ''nuc'' respektive   ''mecA'' amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat.  Förväntade Tm för ''mecA'' PCR-produkt är runt 78,6°C, för ''mecA'' LGA251 runt 80.0°C och för ''nuc'' runt 79,2°C.

@@ Rad 48: / Rad 48: @@
 Följande amplifieringsprofil används:
+[[Fil:MRSAPCR.jpg|thumb|550px|center||]]
 ====Tolkning av resultatet====

@@ Rad 7: / Rad 7: @@
 ''förgreningssidan [[MRSA]]''
 ----
-Genotypisk MRSA-verifiering med LightCycler
+==Genotypisk MRSA-verifiering exemplifierad med metod för ''LightCycler''==
-Indikation
+===Indikation===
-                      Verifiering av meticillinresistens hos S aureus genom att påvisa mecA-gen och nuc-gen.
+Verifiering av meticillinresistens hos ''S. aureus'' genom att påvisa ''mecA''-gen och ''nuc''-gen.
 MecA-genen kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sänkt affinitet för b-laktamantibiotika,.vilket gör olika arter av mecA-bärande stafylokocker resistenta mot alla b-laktam-antibiotika inkluderande batalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. Särskilt allvarligt är meticillinresistens hos S. aureus, eftersom antibiotika ur denna grupp sedan länge utgjort standardterapi vid infektioner med sådana bakterier. MecA-genen sitter på en mobil kasettkromosom och är därmed benägen att sprida sig.