Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) - Versionshistorik

Magnus Thore: /* Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) */

2010-09-04T15:08:17Z

Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)

Magnus Thore: flyttade NASBA till Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)

2010-09-04T12:05:51Z

flyttade NASBA till Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)

Magnus Thore: Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik'' ---- == Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) == '''NASBA''' är en av a…'

2010-09-04T12:05:36Z

Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik'' ---- == Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) == '''NASBA''' är en av a…'

Ny sida

''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik]]''

----

== Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) ==

'''NASBA''' är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription ('''figur 17'''). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av ''[[Chlamydia trachomatis]], [[Neisseria gonorrhoeae]]'' och ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'' [http://www.gen-probe.com Gen-probe] samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV [http://www.norchip.no Norchip]. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; ''reverse transkriptas'', ''RNaseH'' och ''T7 DNA-beroende RNA-polymeras''. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se [[Realtids-PCR]]). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA.

'''Figur 17.''' NASBA reaktionen. Bild; ''Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip,'' [http://www.norchip.no]

NASBA reaktionen startar då primern (P1) hybridiserar till mål-RNAt. Primern innehåller en 5’-terminal T7 RNA polymeras promotor sekvens. Reverse transkriptas förlänger primern, bildar en cDNA-kopia av RNA-templatet som sedan formar en DNA/RNA-hybrid.

RNase H känner igen hybriden som substrat och hydrolyserar, bryter ned, RNA-delen av hybriden vilket resulterar i enkelsträngat DNA. Den andra primern (P2) binder till detta DNA. Reverse transkriptas (RT) förlänger primer P2 vilket gör promotorregionen på DNA-molekylen dubbelsträngad och transkriptionellt aktivt.

RNA polymeras känner igen den nu funktionella promotorn och startar produktionen av stora mängder RNA transkript som är antisense mot den ursprungliga mål-RNA-sekvensen.
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]

@@ Rad 7: / Rad 7: @@
 '''NASBA''' är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription ('''figur 17'''). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av ''[[Chlamydia trachomatis]], [[Neisseria gonorrhoeae]]'' och ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'' [http://www.gen-probe.com Gen-probe] samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV [http://www.norchip.no Norchip]. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; ''reverse transkriptas'', ''RNaseH'' och ''T7 DNA-beroende RNA-polymeras''. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se [[Realtids-PCR]]). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA.
 '''Figur 17.''' NASBA reaktionen. Bild; ''Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip,'' [http://www.norchip.no]
-NASBA reaktionen startar då primern (P1) hybridiserar till mål-RNAt. Primern innehåller en 5’-terminal T7 RNA polymeras promotor sekvens. Reverse transkriptas förlänger primern, bildar en cDNA-kopia av RNA-templatet som sedan formar en DNA/RNA-hybrid.
 [[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]

← Äldre version	Versionen från 4 september 2010 kl. 12.05
(Ingen skillnad)