Nukleinsyrabaserad metod för påvisning av Herpes simplexvirus-bilaga8 - Versionshistorik

Öjar Melefors: /* Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Folkhälsomyndigheten */

2014-01-14T14:56:52Z

Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Folkhälsomyndigheten

Magnus Thore den 21 april 2012 kl. 07.27

2012-04-21T07:27:39Z

Magnus Thore: /* REFERENSER */

2010-01-24T11:09:49Z

REFERENSER

Magnus Thore: /* REFERENSER */

2010-01-24T11:09:30Z

REFERENSER

Magnus Thore: /* Mätintervall */

2010-01-24T11:09:12Z

Mätintervall

Magnus Thore: /* Reagenser */

2010-01-24T11:08:13Z

Reagenser

Magnus Thore den 17 december 2009 kl. 20.47

2009-12-17T20:47:29Z

MagnusT den 23 juli 2009 kl. 08.03

2009-07-23T08:03:42Z

MagnusT den 23 juli 2009 kl. 07.01

2009-07-23T07:01:54Z

Visa ändringar

Magnus Thore: Skapade sidan med '''Huvudartikel:Genital herpes simplex-infektion'' ''Sekundärartikel:Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik'' ---- Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Smitt...'

2009-06-09T13:43:13Z

Skapade sidan med '''Huvudartikel:Genital herpes simplex-infektion'' ''Sekundärartikel:Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik'' ---- Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Smitt...'

Ny sida

''Huvudartikel:[[Genital herpes simplex-infektion]]''

''Sekundärartikel:[[Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik]]''

----

Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Smittskyddsinstitutet

Indikation
Misstanke om infektion med Herpes simplex virus typ 1 eller 2 (HSV-1, HSV-2). Med kvantitativ polymerase chain reaction (PCR)-analys är det möjligt att detektera och kvantifiera antalet virusgenom i provmaterial vilket kan utnyttjas för att följa utvecklingen av genomantal vid behandling.

Analysprincip/teststrategi Med PCR-teknik amplifieras specifika nukleinsyrafragment (DNA-fragment) i närvaro av en fluorescerande probe. Mängden ursprungligt templat i okända prov kvantifieras genom att signalen från proben jämförs med en standardkurva generad från prov med en känd mängd templat. PCR-analysen kan dock inhiberas av olika faktorer exempelvis hämoglobin och proteinkomplex som kan finnas i de kliniska provmaterialen. På grund av detta måste alla prov extraheras innan PCR-analys. Innan extraktion tillsättes sälherpes (PhHV-1) till varje patientprov (spikning), som extraktionskontroll och inhibitionskontroll för prov i PCR-analysen.

Provmaterial
Misstänkt diagnos / Symtom Virus Provmaterial
CNS-infektion HSV-1
HSV-2 Cerebrospinalvätska
Blåsor HSV-1
HSV-2 Blåsinnehåll

• Blåsinnehåll: Förvaras i rumstemperatur, kyl eller frys.
• Cerebrospinalvätska (CSF): volym > 200 µL. Förvara i rumstemperatur, kyl eller frys.

Provtagningsmaterial
• Blåsinnehåll: Virocultrör eller sterilt rör med 250 µL NaCl.
• Cerebrospinalvätska (CSF): Sterilt rör utan tillsats.

Provtransport
• Blåsinnehåll: Kan transporteras i rumstemperatur.
• Cerebrospinalvätska (CSF): Kan transporteras i rumstemperatur.

Reagenser
• Mag Attract® DNA Mini M48 kit, Qiagen art nr: 953336 (extraktion av vätskor i BioRobot M48)
• QIAamp® DNA Blood Minikit, Qiagen art nr: 51106 (manuell extraktion av vätskor)
• Positiv extraktionskontroll för säl (PhHV-1)
• TaqMan® Universal PCR MasterMix, ABI art nr: 4318157
• MgCl2, 25 mM
• Probe för de olika PCR-systemen
• Primrar för de olika PCR-systemen
• Standard (extraherade Namalvaceller som innehåller integrerat EBV DNA)
• Positiv kontroll (acceptor) för de olika PCR-systemen
• Negativ kontroll (NTC) för de olika PCR-systemen

Probe för de olika PCR-systemen
HSV-1: 5'FAM-CAGCACACGACTTGGCGTTCTGTGT-3'TAMRA
HSV-2: 5'FAM-CAGACAAACGAACGCCGCCG-3'TAMRA
Säl: 5'FAM-TTTTTATGTGTCCGCCACCATCTGGATC-3'TAMRA

Primrar för de olika PCR-systemen
Primrarna i HSV-1-systemet är riktade mot US5-genen.
HSV-1 forward: 5'-GGCCTGGCTATCCGGAGA-3'
HSV-1 reverse: 5'-GCGCAGAGACATCGCGA-3'

Primrarna i HSV-2 systemet är riktade mot US4-genen.
HSV-2 forward: 5'-AGATATCCTCTTTATCATCAGCACCA-3'
HSV-2 reverse: 5'-TTGTGCTGCCAAGGCGA-3'

Primrarna i säl Hv-systemet är riktade mot gB-genen.
Säl forward: 5'-GGGCGAATCACAGATTGAATC-3'
Säl reverse: 5'-GCGGTTCCAAACGTACCAA-3'

Analysprocedur
Kort sammanfattning:
• Extraktion av DNA med valt extraktionskit. Innan extraktion tillsättes en inhibitions-kontroll till varje prov (sälherpesvirioner). Om prov spädes ut/koncentreras skall hänsyn tas till det vid beräkningen av genomkoncentrationen. Vid varje extraktion ingår även en extraktionskontroll som extraheras parallellet med övriga prov.
• Rena mixar bereds i templatfritt rum.
• I provtillsättningsrummet blandas extraherat prov med PCR-mixarna. Prover och kontroller fördelas i en 96-hålsplatta. Alla prover analyseras i duplikat för respektive PCR system. Alla prover analyseras även för sälherpes PCR systemet i en brunn (fungerar som inhibitions- och extraktionskontroll). Standard är 4 brunnar med cirka 5 EBV genom/brunn, 2 brunnar av vardera 50, 500, 5000 samt 50000 EBV genom/brunn. NTC (reagenskontroll utan templat, negativ) för respektive PCR system, i triplikat. Acceptor (positiv kontroll, cirka 20-50 genom/brunn) för aktuella PCR system, i triplikat. Slutvolymen på 25 µL i varje brunn består av 5 µL extraherat prov/kontroll och 20 µL PCR-mix.
• Alla brunnarna försluts. PCR-analysen sker och analyseras direkt i PCR maskinen.

Bedömning
• För att ett prov skall bedömas som negativt skall båda brunnarna med aktuellt prov vara negativa. Samt att inhibitionskontrollen skall vara positiv, bör vara minst 20% positiv jämfört med extraktionskontrollens värde (sälherpes).
• För att ett prov skall bedömas som positivt skall båda brunnarna med aktuellt prov vara positiva. Samt att inhibitionskontrollen skall vara positiv, bör vara minst 20% positiv jämfört med extraktionskontrollens värde (sälherpes).
• Om endast en brunn av ett prov i duplikat blir positiv ska behörig utsvarare bedöma om provet ska svaras eller analyseras om. Om det finns tillräcklig mängd provmaterial kvar av ursprunget utföres en ny extraktion med efterföljande PCR-analys. Vid otillräcklig provvolym repeteras enbart PCR-analysen utan ny extraktion.
1. Om prov blir negativt i duplikat vid upprepad undersökning bedöms provet som negativt och besvaras så, om inhibitionskontrollen är OK.
2. Om prov blir positivt i duplikat vid upprepad undersökning bedöms provet som positivt och det erhållna genomantalet från denna analys besvaras, om inhibitionskontrollen är OK.
3. Om endast en brunn av ett prov i duplikat blir positiv vid upprepad undersökning och inhibitionskontrollen är OK, beräknas genomantalet i denna enstaka brunn. Därefter beräknas medelvärdet på genomantalen från de två analystillfällena. Medelvärdet besvaras.
• Om negativa extraktionskontroller som extraherats parallellt med patientprov blir positiva måste patientprov som är positiva extraheras om. Negativa patientprov kan besvaras.
• Om NTC för ett virus blir positiv måste positiva patientprov för detta virus analyseras om. Negativa patientprov kan besvaras.
• Om patientprovets inhibitionskontroll blir negativ måste prov om möjligt extraheras om för att sedan analyseras på nytt.
• Om acceptorn för ett virus blir negativ eller lägre än förväntat skall alla prov för detta virus analyseras om, ny extraktion är ej nödvändig.
• Om acceptorn för ett virus blir högre än förväntat skall alla positiva prov för detta virus analyseras om, ny extraktion är ej nödvändig. Negativa patientprov kan besvaras.

Prestanda
Nedre detektionsgräns för alla virus i detta dokument: 200 genom/mL.
Signifikant skillnad är > 3 gånger skillnad i koncentration jämfört med likadant provmaterial taget tidigare.

Mätintervall
Linjärt mätintervall: 1*103 genom/mL till 10*106 genom/mL.

REFERENSER
HSV-1: Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.

HSV-2: Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.

Säl: G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.

← Äldre version		Versionen från 14 januari 2014 kl. 14.56
Rad 8:		Rad 8:


−	== Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid ~~Smittskyddsinstitutet~~ ==	+	== Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Folkhälsomyndigheten ==
−		+

← Äldre version		Versionen från 21 april 2012 kl. 07.27
Rad 1:		Rad 1:
		+	'''Artikel publicerad år 2009'''
		+	-----
	''Huvudartikel:[[Genital herpes simplex-infektion]]''		''Huvudartikel:[[Genital herpes simplex-infektion]]''

@@ Rad 106: / Rad 106: @@
 == REFERENSER ==
-*HSV-1:	Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.
+*'''HSV-1:'''	Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.
-*HSV-2:	Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.
+*'''HSV-2:'''	Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.
-*Säl:	G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.
+*'''Säl:'''	G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.
 [[Kategori:Laboratoriediagnostik-STI]]

@@ Rad 106: / Rad 106: @@
 == REFERENSER ==
-HSV-1:	Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.
+*HSV-1:	Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.
-HSV-2:	Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.
+*HSV-2:	Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.
-Säl:	G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.
+*Säl:	G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.
 [[Kategori:Laboratoriediagnostik-STI]]

@@ Rad 102: / Rad 102: @@
 === Mätintervall ===
-Linjärt mätintervall: 1*<math>10^3</math> genom/mL till 10*<math>10^6</math> genom/mL.
+Linjärt mätintervall: 1x<math>10^3</math> genom/mL till 10x<math>10^6</math> genom/mL.
 == REFERENSER ==

@@ Rad 45: / Rad 45: @@
 *Positiv extraktionskontroll för säl (PhHV-1)
 *TaqMan® Universal PCR MasterMix, ABI art nr: 4318157
-*MgCl2, 25 mM
+*MgCl<sub>2</sub>, 25 mM
 *Probe för de olika PCR-systemen
 *Primrar för de olika PCR-systemen
@@ Rad 51: / Rad 51: @@
 *Positiv kontroll (acceptor) för de olika PCR-systemen
 *Negativ kontroll (NTC) för de olika PCR-systemen
 === Prober  och primrar ===

← Äldre version		Versionen från 17 december 2009 kl. 20.47
Rad 103:		Rad 103:
	=== Mätintervall ===		=== Mätintervall ===

−	Linjärt mätintervall: 1~~103~~ genom/mL till 10~~106~~ genom/mL.	+	Linjärt mätintervall: 1<math>10^3</math> genom/mL till 10<math>10^6</math> genom/mL.

@@ Rad 1: / Rad 1: @@
 ''Huvudartikel:[[Genital herpes simplex-infektion]]''
-''Sekundärartikel:[[Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik]]''
+''Sekundärartikel till:[[Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik]]''
 ----